利用酵母菌生产蛋白质.ppt

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1、第5章 利用酵母菌生产蛋白质,概述酵母菌的基因组结构及其特点酵母表达系统影响酵母菌中外源基因表达的调控因子外源基因的表达及产物分泌,酵母细胞模式图,1、概述,细菌细胞,外源蛋白表达系统,原核表达系统,-高水平表达 为还原性内环境，不能形成二硫键，某些蛋白不能进行有效折叠,1,外源蛋白表达系统,原核表达系统,-高水平表达 为还原性内环境，不能形 成二硫键，某些蛋白不能 进行有效折叠,1,真核表达系统,相对高水平表达 可发生一定程度的翻译后修饰作 用，有利于实现完整蛋白功能,2,外源蛋白表达系统,原核表达系统,-高水平表达 为还原性内环境，不能形 成二硫键，某些蛋白不能 进行有效折叠,1,真核表达

2、系统,相对高水平表达 可发生一定程度的翻译后修饰作 用，有利于实现完整蛋白功能,2,哺乳细胞系统,-完备的翻译后修饰系统-低表达水平,3,蛋白质表达系统的选择,细菌,哺乳动物细胞,昆虫细胞,酵母菌,增加,人培养细胞,品质,细菌 酵母菌 昆虫细胞 哺乳动物细胞,产量,蛋白质产品,一级结构,二级结构,三级结构,四级结构,螺旋,折叠,高级结构,切割前体。前体蛋白中的某些氨基酸序列如信号肽的切出，形成有功能的蛋白质。蛋白质的糖基化。是将寡糖连接到一个蛋白质分子上，是真核生物细胞表达基因产物时最重要的一种翻译后修饰作用。作用：i.有利于保证所表达的蛋白质进行适当的折叠；ii.保护蛋白质免受细胞蛋白酶的降

3、解。最常见的是O-糖基化（加在Ser,Thr上）和N-糖基化（加在Asn上）。酵母菌中的寡糖通常含有大量的甘露糖残基。,多糖和蛋白质在细胞壁上的连接方式,2.O-glycosidic linkage,1.N-glycosidic linkage,一般酵母菌中的寡糖,1,2,酵母菌突变株mnn9中的寡糖,在酵母菌中的糖基化只能添加富含甘露糖的寡糖，而不形成象高等动物细胞中普遍存在的那种糖蛋白复合物。这种糖基化有时会影响蛋白质的折叠和对蛋白酶的敏感性，更重要的是会影响蛋白质在生物体内的半衰期。,对氨基酸的修饰作用。包括磷酸化、甲基化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羧酸化、豆蔻酸化及软脂酰化等。,在原核

4、生物中，可分泌蛋白质是由N末端信号序列控制合成的，然后通过细胞膜上的“SecY-SecD-SecE-SecF”组成的蛋白质复合物分泌出去。,（3）真核细胞与原核细胞的蛋白质分泌途径,在酵母菌中，分泌蛋白的信号序列为信号识别颗粒（SRF）所识别。SRF包含6种蛋白质分子，并由一个小的RNA分子将其串连在一起。通过SRF与其在膜表面上的受体之间的识别与结合，引导新生蛋白到达蛋白质的输出结构，该结构位于粗糙内质网的特异性位点上。,在原核生物中LPS的产生。LPS的毒性；酵母菌：细胞组分和代谢物对人体是安全的。,（4）安全性,选择性标记基因 启动子 转录、翻译终止信号 给mRNA加上poly(A)复制

5、起始位点,酵母菌表达系统,2、酿酒酵母基因组结构及其特点 1996年 完成全长为12Mb酿酒酵母基因组的测序。酿酒酵母是一种重要的模式生物，也是第一个被测序的真核生物。它有16条染色体，基因组全长为12Mb，含有6000多个基因。它的基因组的测序是作为HGP的一部分于上世纪80年代末期启动，于1996年完成。1997年Nature专门为酿酒酵母基因组发行了增刊。,酿酒酵母的基因组很小，仅有16条染色体。,酿酒酵母细胞既可以作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在有利于发现隐性基因。,12068 kb,5109bp,3.5109bp,1.8108bp,4106bp,基因组全长12068kb，有588

6、5个编码专一性蛋白质的开放阅读框。酵母基因组中平均每隔2kb就存在一个编码蛋白质的基因，即整个基因组有72的核苷酸顺序由开放阅读框组成。酵母基因组的基因间隔区较短，基因中内含子稀少。其开放阅读框平均长度为1450bp即483个密码子，最长的是位于XII号染色体上的一个功能未知的开放阅读框(4910个密码子)，还有极少数的开放阅读框长度超过1500个密码子。酵母基因组中还包含：约140个编码RNA的基因，排列在XII号染色体的长末端；40个编码snRNA的基因，散布于16条染色体；属于43个家族的275个tRNA基因也广泛分布于基因组中。,2.1 酿酒酵母基因组的结构,酿酒酵母基因组的结构,61

7、08,2.2 酵母菌基因组结构的特征,酵母染色体由大范围的GC丰富DNA序列和GC缺乏DNA序列镶嵌组成。GC含量高的区域一般位于染色体臂的中部，这些区域的基因密度较高；GC含量低的区域一般靠近端粒和着丝粒，这些区域内基因数目较为贫乏；酵母基因组另一个明显的特征是含有许多DNA重复序列，其中一部分为完全相同的DNA序列，如rDNA与CUP1基因、Ty因子及其衍生的单一LTR序列等。,S.cerevisiae基因组的测序被称为现代分子生物学历史上最为分散的实验。包括美国、加拿大、欧洲、日本等国家在内的100多个实验室，超过600多名科学家都参与了这项工作。酵母菌研究社群(the yeast co

8、mmunity)，在Andre Goffeau教授(the Universite Catholique de Louvain in Belgium)的领导下，树立了一个效率，合作，组织的典范。这样一种国际合作也是基因组学研究的一个重要特点。,3、酿酒酵母基因表达系统 酿酒酵母作为受体菌的优势：（1）为单细胞真核生物，对其遗传学和生理学的研究较为深入；（2）能快速生长；（3）具有启动活性强的酵母基因启动子；（4）具有内源表达载体和众多的商业化载体（如Invitrogen）；（5）可以对所表达的蛋白质进行多种翻译后修饰；（6）其自然分泌的蛋白质很少，产物处理方便简单；（7）具有较高的安全性。被美国

9、食品和医药管理局（FDA）确认 为一种安全的生物（generanlly recognized as safe,GRAS）。,3.1 酵母菌标记基因leu2的克隆 leu2编码-异丙基苹果酸脱氢酶（-isopropylmalate dehydrogenase），该酶在亮氨酸的合成途径中有重要作用。克隆步骤：（1）提取酵母菌染色体DNA，经适当酶切，建立基因文 库（质粒载体，在E.coli中可复制）；（2）将携带酵母菌基因的质粒电转化E.coli-异丙基苹果 酸脱氢酶缺陷型突变株LeuB，用不含Leu的培养基进 行筛选转化子；（3）抽提转化子质粒DNA，酶切验证后，进行序列分析；（4）leu2基因

10、的结构确认（启动子、RBS、起始序列、终 止序列与碱基数等）。,酿酒酵母选择性标记基因leu2的克隆示意图,3.2 酵母菌表达系统常用载体 酿酒酵母表达系统的常用载体通常有：质粒载体、整合载体和酵母人工染色体。3.2.1 质粒载体 酵母质粒载体通常又可以分为酵母附加型载体(Yeast episomal plasmid,YEp)、酵母复制质粒（Yeast replicating plasmid,YRp）和酵母着丝粒质粒（Yeast centromere plasmid,YCp）三类。（1）YEp 由酵母菌内生性质粒改造而成。酿酒酵母存在一个内生性质粒，大小为6.3kb，长约为2 m，因此又通常称

11、为2 m质粒。具有以下特点：在酵母菌稳定存在，自主复制与分配；在酵母细胞中的copy数可达500100个；,含有一段长度为599 bp的反向重复序列。该序列将该质粒分成2部分，每一部分均含有一个启动子和该启动子控制下的2个基因，其中一个基因称为FLP，编码一个位点特异性的重组酶（recombinase）。2 m质粒结构示意图,2 m质粒的进一步改造：酵母菌-大肠杆菌穿梭质粒（YEp）：加入部分酵母菌核DNA序列和大肠杆菌的质粒复制子；位点特异性重组质粒载体：将E.coli的DNA插入到重组酶识别序列的正向重复序列中，经过重组后该序列可以被丢失。,带polyA序列的磷酸甘油醛脱氢酶终止子,磷酸甘

12、油醛脱氢酶启动子,外源蛋白,筛选标记,（2）YRp 由大肠杆菌质粒载体pBR322改造而成：加入一段来自于酵母菌的自主复制序列，从而使YRp能在酵母菌中复制，但是具有不稳定性，容易丢失。（3）YCp 含有酵母着丝粒序列的质粒载体，能够自主复制，稳定遗传。但是对酵母菌受体菌本身具有较大不利影响。,3.2.2 整合载体（YIp）整合载体不含有酵母菌自主复制序列，不能在酵母菌中复制分配，但含有转座子序列或者酵母菌染色体同源序列，可使其携带的外源基因通过转座子的转座作用或者同源交换作用而整合到酵母菌的染色体上。酵母菌基因组中含有3040拷贝的转座子，称为Ty。Ty与反转录病毒在结构和功能上具有很多相似

13、之处：包含由两个长的ORF和两个长末端重复序列（LTR)。外源基因插入位点,毕赤酵母整合表达载体,AOX1p乙醇脱氢酶启动子；AOX1t带有polyA序列的乙醇 脱氢酶终止子；HIS4组氨醇脱氢酶基因；oripp毕赤酵母复制区；oriE大肠杆菌复制区；Amp氨苄青霉素抗性基因；3-AOX1为乙醇脱氢酶基因3 端的一段DNA序列；箭头处指示发生染色体整合的位点。,3.2.3 酵母人工染色体（YAC）为一种线状DNA载体，最初由酵母菌复制质粒 pSZ213发展而来，含有选择性标记leu2、自主复制序列和端粒序列。现有多种商品化的酵母人工染色体，用于大片段DNA的克隆与序列分析。,酵母人工染色体克隆

14、系统,YAC质粒（pYAC）包括以下元件：（1）Ampr(大肠杆菌抗性标记)（2）oriE（大肠杆菌复制子）（3）酵母菌DNA序列，包括：CEN，具有着丝粒功能；ARS，酵母自主复制序列，相当于酵母菌复制子；URA3，尿嘧啶生物合成基因；TRP1，色氨酸生物合成基因。,酵母人工染色体克隆系统,YAC质粒（pYAC）包括以下元件：（1）Ampr(大肠杆菌抗性标记)（2）oriE（大肠杆菌复制子）（3）酵母菌DNA序列，包括：CEN，具有着丝粒功能；ARS，酵母自主复制序列，相当于酵母菌复制子；URA3，尿嘧啶生物合成基因；TRP1，色氨酸生物合成基因。,T 位点是酵母菌染色体的端粒.SmaI 为

15、克隆插入位点.pYAC质粒先用 SmaI和BamHI进行酶切,然后经碱性磷酸酶处理（防止自连）后连接入外源DNA片段。,4、酵母中外源基因表达的调控因子 在酵母中表达外源基因受到很多调控因子的影响，包括有以下因素：4.1 质粒拷贝数 一般应考虑适用高拷贝数的YEp质粒作为载体，但应注意过高量的外源蛋白表达对酵母菌具有毒害作用，反而导致最终表达量的降低。低拷贝数的YEp质粒，甚至YIp能稳定地获得较高外源蛋白表达量。质粒载体的不稳定性也是影响外源蛋白表达的限制因素，因此在商业生产中必须使用具有很高稳定性能的质粒载体。,4.2 启动子序列 大肠杆菌启动子与酵母启动子的比较：序列：E.coli:TA

16、TAAT Yeast：TATATAA 启动子与转录起始位点的距离：E.coli:10 bps Yeast：40120 bps 酵母菌启动子的上游存在一个上游激活序列（UAS），一般距转录起始位点1001000 bps，因此一般酵母菌表 达载体具有很长的“启动子序列”，通常达到1 kb。一般使用可调控的启动子，可以增加外源蛋白的表达量。,酵母菌中几种适用的可调控启动子：gal1、gal7和gal10等基因的启动子：受葡萄糖阻遏，而受半乳糖诱导；另一正调控物为gal4的表达产物 GAL4；ADH2（乙醇脱氢酶）启动子：受乙醇和葡萄糖调节；PHO5（酸性磷酸酶）启动子：由磷酸盐调节；CUP1（Cu2

17、+结合蛋白）启动子：Cu2+水平调节；温度调控启动子：升温诱导,4.3 转录终止子和mRNA的聚腺苷酰化 在高等动物中，转录终止子一般出现在编码序列下游很远处（几百bp），然后再进行聚腺苷酰化作用，而在酵母菌中，聚腺苷酰化作用往往发生在紧靠转录产物的3端。其终止子序列的精确结构往往还不很清楚。在构建酵母菌表达载体时，往往需要从已了解的酵母基因转录终止的下游序列中克隆一大段终止序列片断，将其放到需要表达的基因编码序列的下游。4.4 mRNA的稳定性 在需要表达的外源基因编码序列的下游有必要克隆一个有效的酵母终止序列，才能增加mRNA的稳定性。,4.5 起始密码子AUG的识别 除了高效转录外，高效

18、翻译也是决定外源蛋白表达量的影响因素。起始密码AUG必须容易被起始因子和核糖体准确识别，而起始密码附近序列决定翻译启动的效率。一般在紧靠AUG密码前2040个碱基中G出现的频率很低（大约5），而如果G在这个区域大量出现，就会抑制翻译的启动。4.6 酵母菌密码子的偏爱性 在酵母菌中表达的外源基因可能携带有酵母菌很少使用的密码子，这样就会减缓翻译过程，若这些密码子成串排列，则对翻译特别有害。解决办法：使用酵母菌偏爱密码子，可以通过分析哪些连续高水平表达内源基因所采用的密码加以确定。,4.7 外源蛋白的折叠 许多外源基因在酵母菌中得到高水平表达，并能进行正确折叠，而在细菌中往往形成包含体（Inclu

19、sion body）。原因：细菌细胞为一个还原环境，不能形成二硫键；酵母细胞内存在多种分子伴侣。4.8 蛋白质的稳定性 在酵母菌中表达单一外源蛋白也会受到酵母菌蛋白酶的降解，尤其是N端裸露的单一蛋白。解决办法：改变N末端的序列，或者和内源蛋白构建融合蛋白，这样在后处理中再设法去除非必需的融合成分。,4.9 外源蛋白的糖基化作用 通过内质网-高尔基体分泌的动物蛋白一般都会在分泌过程中发生糖基化作用，这一过程可能有助于蛋白质的正确折叠，增强它们对于蛋白酶的抗性。但是，在酵母菌中发生的糖基化只会添加富含甘露糖的寡糖，而不会形成象在高等动物细胞中普遍存在的那种糖蛋白复合物，这种糖基化作用有时会影响到蛋

20、白质的折叠和对蛋白酶的敏感性，更重要的是会影响蛋白质在生物体内的半衰期。另外，在酵母菌中表达的外源蛋白也可能发生超糖基化，即每个N-寡糖链上都含有100个以上的甘露糖，而正常的高甘露糖寡糖链仅含有813个甘露糖。过多的甘露糖可能会影响蛋白质的生物活性及其免疫原性。,5、酵母中外源基因表达及产物分泌5.1 乙肝病毒表面抗原（HBsAg）在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达 构建过程（Merck）：（1）将HBsAg编码基因克隆到乙醇氧化酶基因（aox1）启动子的下游；下游加上该基因的终止子和加poly(A)信号；（2）加入可在巴斯德毕赤酵母中复制的复制子、大肠杆菌pBR32

21、2的复制子、大肠杆菌的选择标记、一段帮助该质粒整合到特定染色体位点的序列（3-aox1）以及His合成过程中所需的His脱氢酶基因（his4）。（3）受体菌采用His脱氢酶缺陷型（His4-），经过双交换后，染色体上的aox1丢失，而整合入aox1启动子-HBsAg-aox1终止子及加poly(A)信号序列、his4和3-aox1。,整合后的细胞可在不含His的培养基上生长，或者选择哪些在甲醇存在下生长缓慢的细胞，因为aox1丢失后，仅剩aox2可以起作用了，而aox2没有aox1有效，因此aox2可以使整合细胞在不含His的甲醇培养基中缓慢生长。,5.2 在酿酒酵母中表达分泌型的重组蛋白 在

22、酵母菌中，只有分泌型的蛋白才能够糖基化，因此，凡是需要糖基化的重组蛋白都必须是分泌型蛋白。表达的外源蛋白在向外运输的过程中，会进行二硫键形成、蛋白质水解等翻译后修饰。一般来说，分泌到胞外后就成为具有活性的蛋白。前导肽的作用是引导蛋白质穿膜，使蛋白质分泌到壁膜间隙。用酿酒酵母表达分泌型外源蛋白时，要求在前导肽（信号肽）的C端是Lys-Arg。因为蛋白分泌到胞外时，酵母菌的内切蛋白酶会识别Lys-Arg并切除前导肽，把Lys-Arg密码子紧接在cDNA基因之前，那么除去前导肽后就是正确的蛋白了。构建过程：在外源cDNA上游加上编码酵母交配型因子1的前导肽的DNA序列。,应用：（1）水蛭素（hirudin）的表达 水蛭素是一种强抗凝剂，在人体内没有免疫副反应，可望发展成一种有效的溶血栓药物。,（2）牛溶菌酶C2在毕赤酵母中的表达 牛溶菌酶可作用于细菌的细胞壁，促进反刍动物消化的饲料添加剂。,5.3 在酵母中表达重组蛋白的局限性（1）与原核表达系统相比较，酵母表达系统表达的重组蛋白的表达量明显较低；（2）质粒的不稳定性。在大量表达外源蛋白时，即使是使用诱导型启动子的质粒，往往也容易发生质粒丢失的现象；（3）超糖基化作用。（4）部分表达的分泌型蛋白停留在壁膜间隙，使得分离纯化变得十分困难，生产成本增加。,