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1、荧光探针定量PCR技术在临床实验室诊断中的应用,重庆医科大学附属第一医院检验科 胥飚,38,200,000(PCR)8,800,000(周杰伦）,内 容 提 要,一、基因诊断技术在医学检验中的地位二、荧光探针定量PCR的技术特点三、荧光探针定量PCR在临床医学中的应用,临床实验医学发展,三个时代 标志技术 性质生化诊断时代 生化分析 表象免疫学诊断时代 酶免、放免 表象分子(基因)诊断时代 基因体外扩增(PCR)本质,基因诊断技术的发展及在临床诊断中的地位,基因诊断（分子诊断）：以核酸作为诊断的物质基础 主要包括：遗传性疾病 有遗传趋向疾病的连锁分析 疾病及肿瘤易感基因的分析 病原体的检测 亲
2、子鉴定和个人认定 人类基因组计划（HGP）与基因诊断 基因诊断技术：PCR技术为其标志性技术,聚合酶链反应（PCR）PCR：Polymerase Chain Reaction基因体外扩增技术Saiki PK 等 1985年 Science 230：1350Mullis K 1993年 诺贝尔化学奖,PCR循环次数与DNA产量关系循环次数 DNA的链数1 22-2 22 23-2 63 24-2 1410 211-2 204615 216-2 6553420 221-2 209715025 226-2 67,108,86430 231-2 2,147,483,646,荧光探针定量PCR的技术特点
3、,第一代PCR技术：变性、退火、延伸 结果判断：电泳 缺点：假阳性（污染）、假阴性（灵敏度低）定性检测第二代PCR技术：常规PCR+探针 例如：荧光探针PCR技术 PCR-ELISA,荧光探针定量PCR技术的原理及过程,分 子 学 基 础：常规PCR+荧光探针（TaqMan荧光探针)酶 学 基 础：Taq酶的5 3外切核酸酶活性荧光化学基础：荧光报告基团和淬灭基团标记探针 荧光共振能量转移原理(FRET)Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，其 含义是：每个反应管内的荧光信号到达 设定的阈值时所经历的循环数。,定 量 的 实 现：1、荧光探针与扩增产物结合 2、Taq酶外切作用，
4、探针裂解，荧光 被激发 3、荧光信号的检测 4、荧光强度与定量核酸模板相关性 5、实时定量与终产物定量,荧光定量PCR技术的主要优点,一、真正的样品原始核酸模板的准确定量二、定量范围宽（01010/ml)，无需梯度稀释三、封闭状态检测，避免扩增产物污染四、探针使用使特异性更强五、光谱分析技术使敏感性更高六、仪器读数，结果判断客观真实七、无需PCR后处理，操作更简便、快速八、数据电脑管理，利于医院管理,荧光定量PCR技术检测的报告形式,一、报告形式：荧光定量PCR检测的报告以：“拷贝数”（copy)二、拷贝数的意义：表示原始标本内可供探针结合的核酸片段数量。三、拷贝数与病原体的关系：拷贝数与病原
5、体的数量成正相关 一般来说：细菌是单拷贝的，病毒是多拷贝的。,检测结果分析,荧光定量PCR检测结果的正常值？外源基因：正常值：0拷贝 0拷贝：根据临床表现内源基因：正常值：参照正常细胞相关基因表达水平,FQ-PCR在临床医学中的应用,1、病原体的定量检测；2、肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测；3、遗传病基因的检测；4、与疾病相关的各种蛋白质（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的定量检测；5、药物疗效的考核手段。6、建立病原体的分子诊断标准,FQ-PCR在病原体检测中的应用,一、肝炎病毒定量检测二、优生优育相关项目检测三、结核杆菌及呼吸道病原体检测四、性病病原体检测,129例HBV定
6、量检测结果,ELISA 总数 阳性例数 阳性率 平均数量 范围大三阳 81 81 100%3.98108/ml 2.0 1078.01010/ml小三阳 48 39 81%3.30 106/ml 1.2 1033.8 106/ml,HBV病毒载量与乙肝感染各期,平均拷贝数 HBeAg阳性慢性乙肝 47例 8.3X108拷贝/ml 干扰素治疗后HBeAg转阴 40例 6.2X103 拷贝/ml 非活动性HBsAg携带者 57例 5.6X103 拷贝/ml HBV阳性痊愈后12个月 42例 0 拷贝/ml Clin Diagn Lab Immunol 2000 Mar;7(2)298-300,肝炎
7、病毒载量与疗效 有专家提出103/ml做为临床治愈标准之一 肝炎病毒载量与干扰素治疗 Kato(93)：HCV高，干扰素不敏感 HCV低，干扰素敏感 Marcellin(95)：HBV100pg/ml组：11/30转阴 HBV100pg/ml组：1/30转阴 根据病毒载量选择药物 拉咪呋定有显著降低高病毒载量作用,筛选肝炎治疗药物 中医药的现代化研究肝炎病毒传播途径 垂直传播（母婴）血清与唾液、乳汁和精液肝炎病毒量的相关性肝炎病毒（基因型、载量）与肝癌发生的关系,HIV载量与传染,选择415对性伴侣（来自15，127人）观察时间30个月；男 女12.0%，女 男11.8%；51对性伴侣（1,5
8、00copies/milliliter)没有证据 传染；The New England Journal of Medicine 342:921,Mar 30,2000,EB病毒载量与鼻咽癌,血浆EBV载量与鼻咽癌显著相关 鼻咽癌病人血浆EBV与肿瘤复发相关 10个复发病人：32，250copies/ml 15个二年持续缓解病人：0 copies/ml 17个随访病人：临床恶化前6月显著升高 Cancer Res,1999 Nov,59:21,5452-5,优生优育相关项目检测,引起宫内感染病原体的定量检测 母体病原体的量与宫内感染的关系遗传病产前诊断胚胎植入前诊断,FQPCR诊断TORCH综合
9、征,传统的TORCH病原体：TOX,other,RV,CMV,HSV新近发现的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘带状 庖疹V、肠道V、乙肝V、丙肝V、HPV、EBV、HIV、人疱疹V6、人微小病毒B19等,TORCH感染的实验室诊断,一、组织培养：慢，费力，阳性率低二、血清学诊断：IgG：流行病学调查 IgM：有一定的意义，但存在问题：1、不能定量分析 2、抗体的产生受多种因素的影响 3、产生假阳性,三、基因诊断方法,原理：检测TORCH病原体的核酸优点：1、客观指标 2、敏感性、特异性高 3、定量指标FQPCR在TORCH诊断中的应用：1、筛选TORCH的患者 2、建立TORCH的分子诊断标
10、准,FQPCR在TORCH检测中的应用,一.FQPCR技术用于TORCH抗体阳性者的检测二.FQPCR技术用于TORCH病原体载量的检测三.分析TORCH病原体载量与宫内感染的关系四.建立本地区TORCH病原体感染的分子诊断标准,FQPCR技术用于遗传性疾病的产前诊断,一、等位基因的检测 双色荧光分别标记正常和突变基因，判断正常、纯合子、杂合子二、多基因遗传病的突变检测三、基因表达异常所致的遗传病,地中海贫血的基因诊断,一、地贫的诊断：检测株蛋白基因（16号染色体）的缺失二、地贫的诊断：1、扩增出株蛋白基因（11号染色体）的片段 2、反向斑点杂交,FQPCR技术用于性别鉴定,FQPCR检测SR
11、Y基因：取材：1、孕妇外周血（胎儿性别鉴定）2、头发等（性别鉴定）注意事项：女性操作、阴阳性对照 临床应用：伴性遗传病的检测,FQPCR技术检测21三体综合征,孕妇外周血中有胎儿的少量细胞 通过PCR技术检测孕妇外周血中的胎儿细胞Increased fetal DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying feruses with trisomy 21 Clin chem,1999 Oct,45:10,1749-51,FQPCR技术用于植入前诊断,移入前诊断是第三代试管婴儿的核心技术在胚胎分裂至48细胞阶段时，取12个细
12、胞作筛选技术难点：细胞数少，获取核酸困难。需要高灵敏度 的检测方法发展方向：筛选疾病基因、常见病基因、肿瘤基因等FQPCR双色及多色荧光标记技术的应用,FQPCR用于肺部感染的诊断,一、肺炎支原体的检测：二、肺炎衣原体的检测：意义：1、快速诊断 2、治疗方案与细菌感染的治疗方案 不同,FQPCR技术用于幽门螺杆菌（HP）的检测,HP与慢性胃炎、胃溃疡、胃癌有密切的关系我国胃癌发病率高、发病年龄轻与HP的感染与关系方法：取胃活检标本 口腔标本意义：1、HP感染的诊断 2、探讨HP载量与治疗的关系,FQPCR技术对性传播疾病的检测,一、梅毒螺旋体（TP）二、淋球菌（NG）三、沙眼衣原体、解脲脲原体
13、（CT、UU）四、单纯庖疹病毒（HSV）五、乳头瘤病毒（HPV）六、人类免疫缺陷病毒（HIV）七、其它病原体,FQPCR技术检测CT、UU,发病率最高的性传播疾病 治疗与淋病完全不同 FDA批准的PCR检测试剂盒 意义：可作为首选方法,FQPCR技术检测HIV,HIV载量与感染的发展和愈后 Bagnarell:(92)HIV量高,免疫缺陷症状严重、潜伏期短 Pantaleo(95)HIV量低，潜伏期长，症状轻 根据HIV量预测发病时间和预后,FQ-PCR在肿瘤研究和诊断中的应用,一、病毒感染与肿瘤二、肿瘤相关基因的检测:常见癌基因C-erbB2、c-myc、N-myc、K-ras、int2、N
14、-ras、Mdm2、C-fas、K-sam、Met.三、肿瘤标志物的mRNA表达,关于结核杆菌等5项检测的 具体应用,概 述 用于临床PCR常规检测三条件：SDA批准使用的试剂盒 国家批准符合要求的实验室 经行政部门同意并培训后持证上岗,结核分枝杆菌(TB),靶序列来源:a.单抗检出的TB抗原旦白编码基因 b.TB特异性核酸片段克隆 c.插入序列,实验设计特点,结核的PCR临床主要应用 a.结核与其他分枝杆菌区分 b.结核耐药基因 c.对含菌量低的标本的分离 d.为临床可疑者捕捉信息,临床评价,沙眼衣原体(Ct),实验设计特点 靶及引物选择 外膜蛋白基因(MOMP-OMPI)7.5KD质粒 隐
15、蔽性基因质粒拷贝 16srRNA基因,临床评价 细胞培养 McCoy.Hela-229金标准 ELA法 PCR法.专家希望此法为新金标,HBV-DNA,临床评价：1.一 般临床靠免疫标志，但无法明确时可测2.拉米呋定、阿德福韦及干扰素治疗监测3.新问题研究,HCV-RNA,实验室设计特点 需扩增二次 低温启动UDG系统-RNA不稳定性,注意事项 防止RNase污染 杜绝溶血,临床评估：定性用于诊断(只凭抗HCV，无法 决定病毒存在状况）定量用于治疗监测 基因分型,HLA,方法:免疫学 分子生物学：PCR SSCP RFLP 基因芯片I 类(A,B,C)与疾病发生频率有关II 类(DR,DQ,DP)等 移植配型,PCR 在临床检验应用中的局限性,差之毫厘，失之千里 1.要求高，影响因素多，严格遵守操作规范 2.假阳性：实验条件设计欠佳；扩增产物或核酸提取中标 本间的交叉污染 3.假阴性：在临床标本核酸提取过程中,靶核酸的丢失；提取试剂(如有机溶剂等)的残留、标本中抑制 物的去除不彻底；扩增仪孔间温度差异,质量保证措施,防止假阳性：实验室首先要有严格的分区；使用带滤心的吸头；阴性质控样本应与临床标本一起处理,并适当散在分布于不同标本之间防止假阴性：设立“内标”通过认证的参考品,谢 谢！晚 安！,
