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1、GUS活性的定量检测目的：定量检测转基因植株中报告基因GUS的表达水平用途：比较某个启动子在不同组织中的表达强度，比较不同启动子在同一组织中的表达强度。试剂： 磷酸缓冲液母液：0.2M Na2HPO4： 71.64g/L Na2HPO4-12H2O0.2M NaH2PO4： 31.21g/L NaH2PO4-2H2O GUS 抽提液（1L）： PH=7.00.2M Na2HPO4152.5mL0.2M NaH2PO497.5mL14.3M &ME700uLNa2-EDTA2H2O 3.72gTriton-X 100 1mL 10mM 4-MUG （10X）： 105.6mg 4-MUG 溶于
2、30mL GUS 抽提液中，4C避光保存。（注意：存放时间越久本底信号越强，尽量现配现用）。 0.2M Na2CO3反应终止液（1L）： 21.2g Na2CO3溶于 1000mL ddH2O。 BSA 母液（4ug/ul）： 40mgBSA 溶于 10mL ddH2O 4-MU 母液（10mM）： 17.6mg 4-MU 溶于 10mL 0.2M Na2CO3 中，4C避光保存。 Protein Assay Buffer （5x，Bio-Rad cat.no.500-0006）：使用前要用 ddH2O 稀释成 1x工作液仪器及用品：酶标仪 TECAN Infinite M200酶标板（Nun
3、clon 96 Flat Transparent和 Greiner 96 Flat Black）操作步骤与注意事项：1.材料于液氮中研磨成粉末，取适量粉末加入3倍体积的GUS抽提液，充分混匀，置冰上。（注意，尽量保证每个样品所取的粉末量都比较一致，这样抽提出来的总蛋白浓度比较 接近，方便后续操作。）2. 10000g 4。离心10min,上清液转移到新的1.5mL离心管，则得到总蛋白粗提液（可于4 度短期保存或于-70C长期保存；但不要存于-20。，该温度下GUS不稳定）。3. 总蛋白浓度测定（Bradford法）：3.1先取BSA标准品（4ug/ul）,用ddH2O稀释8个梯度，浓度分别为2
4、000ng/ul、1000、500、 250、125、62.5、31.25、15.625 ng/ul。方法：取 8 个管子，各加 50uL ddH2O,取 50uL 4ug/ul 的BSA母液加入第一个管子，吸打混匀之后从中再取出50uL加入第二个管子，依此类 推。（注意，稀释时至少取50uL进行操作，取少了不准确，浓度偏差会比较大，影响标 准曲线的制作。稀释后可在4C短期保存。）3.2将各个样品的总蛋白抽提液、空白对照（GUS抽提液）以及8个BSA标准品各取2uL加 入到透明酶标板（Nunclon 96 Flat Transparent）中，加入 198uL 1 Protein Assay
5、Buffer， 在5-20min时间内测定595nm的吸光值。（注意，放置超过20min会产生沉淀。）3.3 TECAN Infinite M200程序设置：（开机、关机顺序请见酶标仪上面的说明书）打开Magellan软件，点击将弹出放酶标板的座子，将酶标板放上去之后再点一下则把酶标板送入酶标仪。（注意：不是用手推的！放酶标板的时候要记住自己加样的位置，有没有盖盖子）TECAN 选择creat/edit a method，点击 ，选择new则可新建一个方法。首先选择酶标板型号Nunclon 96 Flat Transparent，如果盖了盖子就在plate with cover前打勾；其次选择
6、样品所在的位置，黄色表示该孔加了样品，仪器只检测黄色区域。 继续选择测量方法，从左侧选项中找到Absorbance,鼠标左键选中，拖拽到中间松开左键则建立吸光度测定方法，再在出现的选项框中选择合适的参数:测定595nm，还可根据需要选择内参（reference），每个孔测定次数与位置（multiple reads per well和 Number of flashes）等。再点击 ，在出现的界面中填写空白对照（）、标准品（ST）和样品SM的位置。（填清楚了是防止遗忘，二还可以通过软件自动计算出样品浓度；也可以全部选SM，后期自己用excel计算，依各人习惯。），保存方法，若选择. 则在保存后马
7、上开始测量。 测量结束后，选择edit-copy to excel则可将结果导出到excel中。点击，保存结果，最后点击，取出酶标板。3.4以标准品的浓度为横坐标，相应的OD595为纵坐标作散点图，添加线性趋势线，显示公式和R2值，将各样品的OD595值代入公式中的y，算出x则为各样品的总蛋白浓度。4. GUS活性的测定：4.1取10-100ug总蛋白（具体用量要先做个预实验确定，注意叶绿素含量过高会影响检测）， 加入1mL含有1mM 4-MUG的GUS抽提液中（反应液应提前预热），于37C反应，在第 5min，15min，25min 以及 35min 时各取出 200ul 加入 800ul
8、0.2M Na2CO3 （Na2CO3 有终 止反应以及增强荧光信号的作用）。（注：GUS活性在较长一段时间内会保持线性，所以 第一个时间点并不一定要在把样品加入到底物中的那一刻取，可以过几分钟再取，如第 5min； 一般高表达的每隔5-10min取一次样，低表达的30-60min取一次样，取3-4个时 间点。）4.2准备4-MU标准品，按照稀释BSA的操作用0.2M Na2CO3将10mM 4-MU稀释12个梯度， 分别为1mM、0.5、0.25、去掉高浓度的5个，用低浓度的7个做标准曲线。稀释 好的4-MU可在4C短期保存，注意避光。4.3将反应产物吸出200ul加入到黑色酶标板中（Gre
9、iner 96 Flat Black），每板都要加4-MU 标准品，即7个浓度梯度稀释液各取出40ul，加入160ul 0.2M Na2CO3，上酶标仪检测。4.4 TECAN Infinite M200 程序设置方法同 3.3，不同的是将 Absorbance 改成 FluorescenceIntensity： Excitation 为 365nm， Emission 为 455nm； Mode 选择 Top；滞后时间 lag time 为0；测量时间Integration time不管设成0.1秒还是10秒，最后出来的数据都被自动转 换为1秒的值；Gain类似于量程，对结果产生的数据影响很大，关系到能否拉开差异， 一般用Optimal自动优化。4.5得到数据之后同3.4作标准曲线，计算各个样品反应产生4-MU的浓度。5. 计算GUS活性：pmol 4-MU/ug总蛋白/min
