淋巴细胞抗原受体.ppt

《淋巴细胞抗原受体.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《淋巴细胞抗原受体.ppt（68页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、抗 体,第四节 淋巴细胞抗原识别受体的 编码基因及多样性的产生,n(抗原表位)n(T/B细胞克隆)n(TCR/BCR)n(V基因)机体存在着特异性识别各种抗原的T、B细胞克隆，称T、B细胞库,即TCR、BCR的多样性,一个机体每一个淋巴细胞是不是具有这么巨大数量的V基因库呢？没有。研究证明：不同的V基因实际上是由少数原先分隔的胚系基因片段，在淋巴细胞发生分化过程中，通过重排(组合、拼接及高频突变等)的过程，从而获得了特异性的V基因，产生巨大数量特异的抗原受体以识别不同的抗原，BCR的多样性可达1014，TCR的多样性可达1016。,一、BCR、TCR基因结构及其重排,（一）胚系基因结构：肽链编

2、码基因：编码V区的基因，V区基因的下游是：编码C区的基因重链V区基因由基因片段：V、D、J拼接轻链V区基因由V、J基因片段拼接互补决定区CDR1+CDR2V基因片段，大部CDR3D，其余CDR3J。,14号染色体,2号染色体,22号染色体,BACK,BCR/Ig的重链V区基因 是由三种胚系基因片段：V、D、J拼接而成，轻链V区基因 是由V、J两个基因片段拼接成的。互补决定区CDR1+CDR2V基因片段，大部CDR3D，其余CDR3J。,C区的基因在V区基因的下游，19个，如H的C基因有9个功能性基因。,C区的基因在V区基因的下游，19个，如H的C基因有9个功能性基因。TCR的、链是由三种胚系基

3、因片段：V、D、J 拼接而成，、链基因是由V、J 两个基因片段拼接成的。V、D、J片段各有多个 一个淋巴细胞中只有一个片段参与组成抗原受体V区的编码基因,14号染色体中,7号染色体q,7号染色体p,BACK,TCR的、链是由三种胚系基因片段：V、D、J 拼接而成，、链基因是由V、J 两个基因片段拼接成的。,二、基因重排：1、重组酶：重组激活酶、末端脱氧核酸转移酶、DNA外切酶、DNA合成酶等。2、等位排斥和同种型排斥(1)等位排斥：在一对同源染色体的某一基因座位上，二条染色体的等位基因中只有一个基因能表达。保证了一个B细胞或T细胞只能表达一种特异性的抗原受体。,(2)同种型排斥：表达同一类型肽

4、链的不同基因座位之间的排斥。如表达L链的链基因在第2号染色体上，而链基因在第22号染色体上，在一个细胞内它们不能同时表达，只能表达其中之一，/，：=65：35。,3、类别转换(同种型转换)在抗体应答过程中，B细胞激活后分泌Ig的类别发生转换。类别转换主要与同一V区基因与不同重链C区基因重排有关。,表达CH的基因片段有9个，除了C以外，它们之前都有一个DNA序列重复排列的转换区，如要转换某一类别，其上游的C基因片段即被环出。,4、BCR(膜型Ig)和分泌型Ig 在转录时如只转录到SC(分泌性外显子)，不能表达疏水性氨基酸残基，只能分泌出去。如继续转录至MC(膜性外显子)，则可表达疏水性的跨膜区和

5、膜内区，插入细胞膜，作为膜受体。,在转录时如只转录到SC(分泌性外显子)，不能表达疏水性氨基酸残基，只能分泌出去。如继续转录至MC(膜性外显子)，则可表达疏水性的跨膜区和膜内区，插入细胞膜，作为膜受体。,1、组合造成的多样性,二、多样性产生的机制,2、连接造成的多样性 CDR3区位于V、J和V、D、J片段连接处，可丢失或加入数个核苷酸(N插入)，在末端脱氧核苷酸转移酶作用下，不需模板，直接加入核苷酸至DNA断端，在V-D-J之间，形成VNDNJ，而显著增加了CDR3的多样性,3、体细胞高频突变造成的多样性 外周淋巴组织生发中心内的成熟B细胞，在受到抗原剌激后，已重排好的V区基因(尤CDR3)突

6、变频率增高，称体细胞高频突变，主要为点突变，非随机性。抗原对多株高频突变细胞的选择结果，使其表达的的IgV区CDR(互补决定区)与抗原表位的互补性更优于原先分子，即为抗体的亲和力成熟。,克隆选择学说：Burnet(澳)1957年 免疫细胞随机形成多样性的细胞系(克 隆,Clone),每一克隆细胞表达同一种特异的识别抗原受体，识别相同抗原。胚胎期的免疫细胞系接触抗原后，该细胞系被排除或失去活性，处于抑制状态，成为禁忌克隆，产生耐受。成熟淋巴细胞可识别外来抗原，被选择而活化、产生效应。,三、淋巴细胞的克隆选择,第五节 抗体的功能 一、V区的功能 识别并特异性结合抗原 单体(IgG,IgE)2价 二

7、聚体(分泌型IgA)4价 五聚体(IgM)10价（5价）中和效应 中和毒素和病毒 与Ag结合 促吞噬细胞吞噬,1.抗体的结合价,2.实际意义,二、C区的功能 1.激活补体系统 Ab(IgM、IgG)+Ag C1q 补体经典途径 IgG4、IgA的凝聚物 补体旁路途径 2.介导免疫细胞活性(1)调理作用(opsonization)：IgG+抗原(颗粒性)FcR（单核、巨噬细胞及中性粒细胞）促吞噬细胞吞噬；(2)ADCC：IgG+抗原(靶细胞)Fc R（NK 细胞）杀伤靶细胞；(3)介导超敏反应：型、型和型超敏反应。3.穿越胎盘和粘膜,第六节 各类免疫球蛋白的特性和功能 一、IgG 1.一般特性(

8、1)单体分子；(2)四个亚类；(3)血清中含量最高(75%Ig)；(4)半衰期最长(2123天)；(5)35岁达成人水平(8.017 mg/ml)；(6)可与SPA结合。,2.生物学活性(1)通过胎盘（新生儿抗感染）；(2)激活补体（裂解细胞）；(3)调理作用（促进吞噬）；(4)介导ADCC（细胞毒作用）。3.实际意义(1)抗感染；(2)自身抗体 自身免疫病；(3)介导变态反应(、型)；(4)封闭抗体 肿瘤细胞逃逸；(5)亲合层析法 IgG纯化；(6)免疫学检测。,二、IgM 1.五聚体，分子量最大(900 kd)，又称巨球蛋白；2.人类发育过程中最早合成的Ig；3.体液免疫应答最先产生的 I

9、g 感染早期免疫；4.占血清Ig含量的510%；5.半衰期 5天 血清中特异性IgM 水平增高提示 有近期感染；6.激活补体；7.IgM 不能通过胎盘 脐带血或新生儿血清中IgM 水平升高表明胎儿有宫内感染；8.B细胞膜IgM(mIgM)体液免疫应答；9.自身抗体 自身免疫病,三、IgA 1.两种类型 2.半衰期 6天；3.占血清Ig含量的515%；4.粘膜局部抗感染免疫；5.聚合IgA激活补体替代途径。,血清型：IgA1，单体；分泌型：IgA2，二聚体,粘膜局部浆细胞合成；分泌片由粘膜上皮细胞合成；,Origin of Secretory Component of sIgA,四、IgD 1.

10、单体分子 2.存在形式 分泌型 血清中，功能不清；膜结合型 B细胞表面,3.意义（1）是B细胞成熟的重要标志；（2）抗原受体；4.占血清Ig含量的1%；5.半衰期 3天。,五、IgE 1.单体分子；2.血清中含量最低(占Ig的0.002%)；3.半衰期 3天；4.呼吸道和胃肠道浆细胞产生；5.介导型超敏反应；6.过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异 性IgE水平增高。,第七节 单克隆抗体和基因工程抗体一、多克隆抗体(polyclonal antibody)1.定义 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。2.实际意义（1）预防

11、、治疗感染性疾病（2）临床诊断,二、单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)1.定义 由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗 原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。2.特点 具有高度均一性。3.杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞 无限增殖；免疫B细胞 合成、分泌特异性抗体。4.杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H),氨基蝶呤(A)和胸腺嘧 啶核苷(T)。,杂交瘤技术的理论基础,淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb,当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一

12、起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。,细胞DNA合成途经,1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要途径：氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸谷 氨 酰 胺（A-）尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）,HAT选择培养基的原理,HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T),抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞（B细胞）（B细胞恶性肿瘤）1.抗体分泌（Ig+)1.具永生性 2.HGP

13、RT+在HAT生长 2.8-AG筛选出 HGPRT-株 PEG 融合 HAT筛选 脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）（HGPRT+、Ig+）,融合的结果及命运,未融合的骨髓瘤细胞,未融合的脾细胞,杂交瘤细胞,脾-脾杂交细胞,骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞,免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次）获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）McAb 纯化及鉴定,制备单克隆抗体的基本技术,1 抗原提纯与动物免疫2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合4 抗体检测5

14、杂交瘤的克隆化和冻存6 McAB的制备7 单克隆抗体的纯化,免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）冲击免疫（融合前3天进行）选用6-12周龄Balb/c小鼠,颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，

15、基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。,骨髓瘤细胞系选择要点：稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 等。保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）防止支原体污染（胎牛血清）融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 饲养细胞一般在融合前一天制备,免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一

16、次加强免疫3天后的脾脏。融合比例：骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液,克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染,一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。,克隆化：指将

17、抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染,单抗生产的方法：动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。,单抗纯化方法：,盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析法辛酸沉淀法,用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。血清 50%饱和度硫酸胺

18、上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%饱和度硫酸胺 上清 沉淀 拟球蛋白 r球蛋白,凝胶过滤法,干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。交联葡聚糖凝胶(Sephadex)琼脂糖凝胶(Sepharose),单抗生产的方法：动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。,离子交换层析法,DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质

19、，又称阴离子交换剂CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂,亲和层析法,将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。A蛋白-Sepharose CL 4B,单克隆抗体特性理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备,单克隆抗体在医学中的应用,检验医学诊断试剂（1）病原微生物抗原抗体的检测（2）肿瘤抗原的检测（3）免疫细胞及其亚群的检测（4）激素测定（5）细胞因子的测定蛋白质的提纯肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术,基因工

20、程抗体与抗体库技术,单抗体内应用和疗效受限原因：1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少3.生产成本高,难于普及应用,人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。,临床上欲开展急性心肌损伤特异性标志物人心肌肌钙蛋白I（cTnI）的检测项目，现提供给你重组cTnI抗原，请你设计可行性实验方案。,三、基因工程抗体(genetic engineering antibody)1.定义 在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或修 饰，导入受体细胞表达的抗体。2.举例 人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody)改型抗体(reshaped humanized antibody)小分子抗体 双特异性抗体(bispecific antibody),