《PCR常见问题分析.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR常见问题分析.docx（14页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争 与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下：(1) 将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。(2) 待测管中加受检标本和一定量酶标抗原医学教|育网整理的混合溶液，使之与固 相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含 有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体 结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。(3) 加底物显色：参
2、考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度 与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多1包被抗原，酶标二抗进行的间接竞争法2包被抗原，酶标一抗进行的标记抗体直接竞争法3包被抗体，标记抗原进行的标记抗原直接竞争法，双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：双抗体夹心法一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂 质。二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载 体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗
3、涤未结合 的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度 进行该抗原的定性或定量根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗 原夹心法测定标本中的抗体。双向扩散试验沉淀线的形态和位置的4种分析1. 抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估计沉淀线的形成是根据抗 原抗体两者比例所致。沉淀线如靠近抗原孔，则指示抗体含量较大；如靠近抗体孔，则指示抗原含量较多。不出现沉淀线则表明抗体或抗原过剩。另外，如出现 多条沉淀线，则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，可用于鉴定抗原或抗 体的纯度。双扩
4、散各种孔型图2. 抗原或抗体相对分子量的分析 抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其 速度受分子量的影响。分子量小者扩散快，反之则较慢。由于慢者扩散圈小，局 部浓度较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方。如若两者分子量相等，则形成 直线。图显示左侧沉淀线抗原分子量大于抗体，右侧沉淀线则抗体大于抗原，中 间一条线则为两者相等。抗体多为IgG，分子量约15kD，未知抗原的分子量可做 粗略估计。抗原抗体相对分子量示意图3. 用于抗原性质的分析两种受检抗原的性质可完全相同、部分相同或完全不同。三种情况在双向扩散中表现的基本图形见图三种双扩散基本图形从图可以分析出，左图中两种受检抗原(Ag-a)完全相同，形成一个
5、完全 融合的沉淀线；右图中抗体为双价，两种抗原完全不同(Ag-a和Ag-c)；中图的 抗体为双价，两种抗原(Ag-ab和Ag-ac)皆有相同的a表位，又有不同的b和c 表位，所以沉淀线呈部分融合的形状。这种技术作为抗原的分析，是目前免疫化 学中最常用的鉴定技术之一。4. 用于抗体效价的滴定双向扩散技术是抗血清抗体效价滴定的常规 方法。固定抗原的浓度、稀释抗体；或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释，经过 自由扩散，形成沉淀线。出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。免疫电泳是指一定量可溶性的抗原物质与相应抗体借用琼脂糖为载体在 一定电场强度下以合适的比例加速结合形成复合物，并以沉淀线(或峰)的形式
6、表 现出来，通过观察和分析沉淀线(或峰)的性质而对抗原抗体进行定性定量。该技 术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点，一是加快了沉淀反 应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体 反应，以此做更细微的分析。免疫电泳技术的种类很多，这里仅将常用的技术介 绍如下。电泳的基本原理电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分 子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它 们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带 电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利 用在电场的作用下，由于待分离
7、样品中各种分子带电性质以及分子本身 大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样 品进行分离、鉴定或提纯的技术。目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使 用聚丙烯酰胺凝胶。电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳 槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式 两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中 蛋白质的分离带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同 的迁移速度，有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行 分离，如等电聚焦电泳；而有些类型的电泳则主要依靠分子大小
8、的不同 即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电 泳。分离后的样品通过各种方法的染色，或者如果样品有放射性标记， 则可以通过放射性自显影等方法进行检测.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响1、DNA的分子大小及构型不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA （covalently closed circular, cccDNA）直线DNA开环的双链环状DNA。线状双链DNA分 子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子 越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 当琼脂糖浓度太高时，环状DNA （一般为球形）不
9、能进入胶中，相对迁 移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA （刚性棒状）则可以长 轴方向前进（Rm0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于 凝胶浓度。2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中 各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的 选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA段所需胶浓度是 1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA段大 小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。3、DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有
10、关，还 和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝 胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最 慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒 DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶 上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。4、电源电压琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电 压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与 所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，不同分子量的DNA段的 迁移
11、率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高 幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使 大于2kb的DNA段的分辨率达到最大电场强度不宜高于5V/cm。5、嵌入染料的存在荧光染料漠化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的 碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状 DNA迁移率降低15%。6、离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存 在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小,DNA几乎不移动，在高离子 强度的缓冲液中（如误加10X电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严 重时会引起凝胶熔
12、化或DNA变性。对于天然的双链DNA,常用的几种电泳 缓冲液有TAE含EDTA （pH8.0）和Tris-乙酸,TBE（Tris-硼酸和 EDTA）,TPE（Tris-磷酸和EDTA）, 一般配制成浓缩母液，储于室温。质粒完整的话可以形成超螺旋结构，跑最快；如果有部分单链断裂，还是可以保持环状，但 是无法超螺旋，要跑慢一点；如果双链锻裂，变成线性分子，就跑最慢。电泳出现拖尾现象，英文成为smear，就是弥散。其原因，主要从以下两个方面考虑：1、PCR产物自身原因：往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环 次数过多，而造成PCR的非特异性产物过多。对策
13、：减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+ 浓度。增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。2、电泳体系的问题：（1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染，建议更换缓冲液。（2）上样时样品漂了，建议增 加上样缓冲液的用量，以及小心加样。（3）电压太高。（4）适当把你的胶的浓度加大。（根 据你的片断大小而定）（5）观察你的marker是否也存在拖尾现象，作为对照。引物你是想扩基因还是启动子啊？一般基因的话，你可以用亲缘关系比较近的物种的该基因的序列设计引物，序列可以在NCBI 上查到的，如果是启动子，就可以采用接头PCR，或者是设简并引物来扩，方法很多
14、的（二）假阴性，不出现扩增条带1、模板 模板中含有杂质。 模板中含有Taq酶抑制剂。 模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。 模板核酸变性不彻底。2、酶失活 3、引物引物质量；引物的浓度；两条引物的浓度是否对称；是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见 原因。对策为： 选定一个好的引物合成单位。 引物的浓度不仅要看吸光度值A,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且 两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一 条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合 成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时
15、要平衡其浓度。 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。4、Mg?+浓度5、反应体积的改变6、物理原因7、靶序列变异(三) 假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其 条带更整齐，亮度更高。1、引物设计不合适选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在 进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序 歹M靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重 2崭设计引或扩增产物的交叉污染(1)整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。解决方法： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或
16、溅出离心管外。 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。 所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。（2）空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。可用巢式PCR方法来减轻或消除。（四）出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或 小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环 次数过多有关。对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模
17、板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（五）出现片状拖带或涂抹带减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。十四、PCR污染与对策（一）污染原因1、标本间交叉污染2、PCR试剂的污染3、PCR扩增产物污染4、最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染5、实验室中克隆质粒的污染(二)污染的监测1、对照试验(1) 阳性对照(2) 阴性对照2、重复性试验3、选择不同区域的引物进行PCR扩增(三)防止污染的方法1、合理分隔实验室 标本处理区； PCR反应液制备区； PCR循环扩增区； PCR产物鉴定区其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用 紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。2、吸样枪3、预混和分装PCR试剂4、防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。5、设立适当的阳性对照和阴性对照6、减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。7、Eppendorf管的使用
