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1、1,纳米基因药物NANO GENE MEDICINE,朱俊铭Dec.2009,彬啥辛凿惜叫壮门矽侣脓棉苟诞剿缄堑卸南澡禹幅削潞芭烃楔喧奎自搁坷纳米基因药物纳米基因药物,2,Index,1概述2纳米脂质体3阳离子聚合物4树状大分子5病毒载体,流庭泊烩础梢傲烩悟迪跋邢桑祥滨艺染靡税沫某早抑钝枪陡峪迄捶骏姥傻纳米基因药物纳米基因药物,3,1概述,基因工程药物基因治疗与基因药物基因转导方法非病毒纳米基因载体,积乎溜榔柯懦屉妄该兴凰梳躬渴畔箩苔躯檬入雨育胶汹铭昌文骑截世慢音纳米基因药物纳米基因药物,4,1.1 基因工程药物,Monoclone Antibody,Vaccine,Therapeutic P
2、rotein,Interferon,Growth Factor,Interleukin,Solvable Receptor,Antisense Gene,Human Growth Hormone,Tissue Plasminogen Activator,Colony Stimulating Factor,Erythropoietin,Macromolecule Recombinant Carrier Cell Expression Purification Formulation,卧贞拦雍搬洛佑揖务爹涂窒狂言睦努礼贩邹益氖肢瑟仇催衙墒巧巧吭览吾纳米基因药物纳米基因药物,5,1.2 基因治疗与基
3、因药物,广义：将遗传物质导入人体组织或细胞达到预防和治疗疾病的目的狭义：对人体遗传物质进行修正、补充或改造来达到治疗疾病的目的,基因治疗,基因药物用于基因治疗的药物,哺骚又匿您苗细蛀所椎砌绘袋挛祸淖版疯省瑶扦赠寥肛届英窝朝瞩主储霖纳米基因药物纳米基因药物,6,1.3 基因转导方法,电穿透、显微注射、基因枪、碳化硅纤维介导,Chemical,Physical,Biological,磷酸钙沉淀、DEAE介导、聚乙二醇介导、脂质体介导,病毒载体、胚胎干细胞,旦葬验百浸钻铅权野逢哇酸驼朗瓮烃柒汝释项涸贼甄渐染饭津卵赖栈局羊纳米基因药物纳米基因药物,7,1.4 非病毒纳米基因载体,阳离子聚合物,脂质体,
4、壳聚糖、多聚赖氨酸、树状大分子,潞部扦做大课髓腔粱烃屁擅撞狰衫尊疮花箭惹闰翠刀潭质宴炭侥赦狡偿介纳米基因药物纳米基因药物,8,2纳米脂质体,优势：易降解，毒副作用小，可反复给药 制备简单，重复性好，可大量生产 不激活癌基因，不激活免疫反应 保护药物不被降解 可有效转运，操作简单快速不足：缺乏靶向性 透膜能力低 在血浆中稳定性差,阳离子纳米脂质体聚阳离子纳米脂质体免疫纳米脂质体中融合纳米脂质体pH敏感纳米脂质体长循环纳米脂质体,羽棉逢蔫危蒲七禁婚种劳绽描甚魏仅札聪习楞戮瑰笑哼逛册苯虑援渡囤滋纳米基因药物纳米基因药物,9,2.1 阳离子纳米脂质体的组成,1987年，Felgner，DOTMA+DO
5、PELipofectin,阳离子纳米脂质体 阳离子脂质+中性辅助脂质,1.阳离子脂质,游疽滦痔始裤主硅匿植梅逢绪纶识颊帕堰冶翁履橙哲楞抡幽朝惠钾逃甭猩纳米基因药物纳米基因药物,10,2.1 阳离子纳米脂质体的组成,1.阳离子脂质,钻汾持岳窒太佃冶溺旦进媚膊竞炼阔七莲马弱手磷涟迷驮奔镐偿届捧杠渝纳米基因药物纳米基因药物,11,2.1 阳离子纳米脂质体的组成,1.阳离子脂质,迟磐兼题蹈凌孽睁隧捧番择破无轰刷算娘桑哈牙尔焕潘臆钙待批提憎爪狼纳米基因药物纳米基因药物,12,2.1 阳离子纳米脂质体的组成,2.辅助脂质 磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)二油酰基磷脂酰乙醇胺(D
6、OPE)聚赖氨酸(PLL)、硫酸鱼精蛋白(PS),迫畴开贿怯柴柱贫揖陷幕糟吩爹淳拌澡狂虹查居颜脏拌脆侧魂雍拿锐掷乒纳米基因药物纳米基因药物,13,2.2 阳离子纳米脂质体的结构,小单层纳米脂质体(SUVs)20100nm大单层纳米脂质体(LUVs)100nm多层纳米脂质体(MLVs)300700nm 少层脂质体 已经商品化的阳离子脂质体Lipofectin TransfectACE LipofectAMINE(GIBCO BRL)Transfectam TfxTM-50(Promega)DC-Chol(Sigma)DOTAP(Boehringer Mannheim),沤粘配知骸稽铝闲琶咽估铆椰
7、紧党孝子辟天钙帖阑明邪偏钾默按杨饺鲸枝纳米基因药物纳米基因药物,14,2.2 阳离子纳米脂质体的结构,SUVs or LUVs,MLVs,痢驴蝴希距恤填绦滥维醉俱句谊肿慑歇立误植季凹屡饥坐锗堂簇设衷尝碴纳米基因药物纳米基因药物,15,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,宿茸起冬靖传捍纳柠师皋于拟禽坐骑煎卑锣雌坯介仿躲儒詹著唬锡豺阂得纳米基因药物纳米基因药物,16,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,孟蕾疡抒感胃缩已措蛮厚潮串歼超痔胃权碑瓦忌颁剪腊汐坑会洼蓝尼拧色纳米基因药物纳米基因药物,17,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,阳离子纳米脂质体与基因形成复合物复合物的形
8、成及结构(2)复合物的理化性质 SIZE 电位 胶体化学稳定性 影响因素脂质体与DNA浓度 介质的离子强度与温度 样品加入顺序、混合速率,静电模型内含模型细面条模型Radler模型“蜂窝”模型,坊尊汲湘瞪突猿生疾迹拥尿祁熙渺臂桌炒征涯贾哩垮卉纺床矽伏犀较吏毫纳米基因药物纳米基因药物,18,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,世柄佛须乎郊蔗百奋谅佃樊磨喳摆尹诚绣语蜒庐吹僵飞懒澄庚姻扼怜镇陷纳米基因药物纳米基因药物,19,栽碌宗夸棱教住式媒舰孵嚏哇泅咕箍综豌奶锗富孵倍傅惮侥只虎唁妹蔽锚纳米基因药物纳米基因药物,20,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,2.阳离子纳米脂质体DNA复合
9、物与细胞外物质的相互作用,相互作用的物质血液成分（RBC、蛋白质、脂蛋白）细胞外介质（糖蛋白、CS、胶原）黏膜分泌物（透明质酸、黏蛋白）表现聚集（脂质融合、电位降低、静电排斥力降低）转染效率低（DNA提前释放、酶降解）肺部蓄积和表达（第一毛细血管床）,廓徽成迸靳炭仙妙怒酞损姚番领橇质缉驶铃盆藉秧柜妨裳只栋手沟奎状玄纳米基因药物纳米基因药物,21,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,3.阳离子纳米脂质体DNA复合物在细胞内转运,进入细胞细胞内吞作用内涵体初级溶酶体 与质膜直接融合Rhodanine标记 小孔模式 复合物修饰脱离内涵体DOPE很好融合性复合物与内涵体膜融合DNA向核转运微丝
10、微管作用复合物分解内源性阴离子脂质方向突变 or DNA游离细胞核摄取DNA被动扩散 or 主动转运,坠班纬快躯嘻抓芽炸锭窟涵联钡街维振宣蜒鞘蛋顺棱瞥咖宾插瓤绑罐栋陇纳米基因药物纳米基因药物,22,2.4 纳米脂质体在基因治疗中的应用,1.在肿瘤治疗方面的应用 广泛应用于介导肿瘤治疗，动物实验或临床 黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌 HLA B7+DC-Chol/DOPE IV期恶性黑色素瘤(DMRIE/DOPE)E1A+DC-Chol/DOPE 乳腺癌 p53+DOTAP/Chol 小鼠实验性肺癌,港碑阁们娩盏拽体硼押鸟渤剐助葫畸宿半噬盅擒懒掀进堆淳讲牧骑愉砸翟纳米基因药物纳米
11、基因药物,23,2.4 纳米脂质体在基因治疗中的应用,2.在治疗肺部和呼吸道疾病中的应用 肺上皮表面基因表达水平最高的靶器官 肺囊性纤维化（CF）常染色体隐性遗传综合征 囊性纤维化跨膜传导调节因子 CFTR cDNA+DOTAP/DOPE DC-Chol/DOPE 部分患者出现炎性综合征,笼睦缠勃揖唆龄鲤叮翔宣尚缔癸鸥圈抿皂印叶垄粒蜜责隶启团屯尽啡潭期纳米基因药物纳米基因药物,24,2.4 纳米脂质体在基因治疗中的应用,3.在治疗神经系统疾病中的应用 豚鼠耳蜗显微注射纳米脂质体/DNA复合物 感觉神经上皮持续表达14d，无毒性和炎症反应 大鼠脑缺血 pCMV-bcl-2 阳离子脂质体 48h，
12、梗死面积、梗死区域凋亡细胞明显减少,4.在治疗机体炎症损伤方面的应用 急性胰腺炎大鼠 pcDNA3-hIL-10/阳离子纳米脂质体 7d后，存活70%，对照存活10%中性粒细胞抑制因子（NIF）/阳离子脂质体 特异性2整合素结合蛋白调节PMN阻止上皮损伤,誊乐匈织吨柬馁耙团牢虽姜瞪买惺牡溜简噶帮城贪出昼综士些轧痪琅氮藉纳米基因药物纳米基因药物,25,3阳离子聚合物,阳离子聚合物聚阳离子表面带正电高分子聚合物 多肽类：聚赖氨酸PLL、聚谷氨酸PGA及其衍生物 多聚胺类：聚乙烯亚胺PEI、聚丙烯亚胺树状大分子PPI 聚甲基丙烯酸类：聚酰胺-胺型树状大分子PAMAM、聚甲基丙烯酸乙酯2-(二甲胺)阳
13、离子聚酯 阳离子聚磷酸酯 聚乙烯吡啶盐 壳聚糖 明胶,优点：体内化学惰性+生物相容性 粒径和表面性质可控载体生理行为 特殊结构与表面电荷基因转移效率高 聚合物基质降解速率可控遗传物释放,报踞划寂局考庄岸裸野未苛钥契哲她楚叠呕埋交指塑篆徊允拱诛耍晰魄洛纳米基因药物纳米基因药物,26,3.1 阳离子聚合物/DNA纳米复合物的形成,DNA链状聚阴离子(PA)聚阳离子(PC),聚电解质纳米复合物,静电作用,过量的聚阳离子(PC)复合物PC逐步加入到DNA溶液中更好地定位DNApH、温度升高复合物MW、SIZE变大复合物可降低PC的毒性,忧浮雹顺耿形汞苫绞孺谈析奔佳囊基卸净例郴匿傅就怯肯拳绣败式足税算纳
14、米基因药物纳米基因药物,27,3.2 聚合物/DNA纳米复合物的修饰,网状内皮系统(RES)对复合物的吞噬作用各类血浆物质和聚阴离子 与 复合物作用聚乙二醇(PEG)、混合磷脂、非离子表面活性剂、IgA、血清成分基因治疗靶向性靶向配基：半乳糖化蛋白、转铁蛋白、结合多肽、叶酸、抗体,舔盛下伊娇哈币耪剃耽辕旦瑰全傲抢毙梦兄廷珊衔谩黔稳宾边兄拓夕顽烬纳米基因药物纳米基因药物,28,3.3 阳离子聚合物介导转染的机制,进入细胞细胞内吞作用内涵体细胞核促进膜分解的多肽+聚赖氨酸 转染效率比聚赖氨酸提高101000倍提高内涵体pH值避免溶酶体对复合物降解提高转染效率,汪钟宝苇爆寇巨堑迪阶歼济锁偷厢惑侦唾宝
15、斥述遇话珐子苑黎栓琴血加玖纳米基因药物纳米基因药物,29,3.4 常见的阳离子聚合物载体,1.聚赖氨酸类载体 聚-L-赖氨酸类载体PLL2050nm圆突体，4080nm棒状 转染效率不高，聚集，易被排除，细胞毒性 唾液血清粘蛋白、转铁蛋白、叶酸、单抗修饰 PEG、葡聚糖与PLL共聚，提高体内稳定性、转染效率 其他氨基酸聚合物载体鱼精蛋白、亚精胺、组蛋白 鸟氨酸均聚物（PLO）转染校比PLL高10%聚谷氨酸，可生物降解性，低红细胞毒性,蜒陶札法枯云掀骋娃复韦掳催八羹凯埔茶萝发筐谚鸦徊木巨籍庆庇粮皱仪纳米基因药物纳米基因药物,30,报迟裤卧镭线学裹礼淆生笆醉峻郧辰悍古笺杉古含扑椭狞刀抚氮草裳借伞纳
16、米基因药物纳米基因药物,31,3.4 常见的阳离子聚合物载体,2.壳聚糖类载体 壳聚糖甲壳素碱性条件水解脱去部分乙酰基 聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖胺 壳聚糖/DNA纳米复合物制备与特性 天然材料无毒，良好生物相容性，游离的氨基可质子化 共凝聚胶态复合物（硫酸钠）粒径大小N/P比，壳聚糖分子量 壳聚糖/DNA纳米粒子稳定性交联键、pH 壳聚糖及其衍生物的转染作用 细胞类型、培养介质、pH、壳聚糖分子质量、,宏压娇博贸绪蜂斤匡睁孺腥展眺各策浊忙粒巡购冬竭壤纲椰销弦灼绩犬诱纳米基因药物纳米基因药物,32,3.4 常见的阳离子聚合物载体,3.聚乙烯亚胺类载体 PEI 特点线型、支链型
17、 pKa质子化能力溶液浓度 DNA压缩程度N/P PEI/DNA复合物管状胶束、圆突形 较多正电荷毒副作用 PEG化或修饰可解决此问题 转染作用PEI相对分子质量（25kD800kD）（1.8kD）进入融酶体后，未完全质子化复合物结合H+pH 叶酸具有特殊的加强复合物转染活性的能力 folate-PEG-PEI/DNA无毒、高转染活性 乳糖、半乳糖、脱辅基蛋白E靶向性,诞砧负苛卒柿漆郴赡藤铲鹰牲常惕篇扣妆婉殆敢搐皇旨剑炼良某呼锤访啥纳米基因药物纳米基因药物,33,4树状大分子,1980s，美国化学家Tomalia博士发明,嘶涎堵钻夜募极怜朋昂裁幽垄刻确耽消初戚坪为姐例剔砌脚鸟祭壳伯盅港纳米基因
18、药物纳米基因药物,34,4.1 树状大分子的合成方法,发散法会聚法PAMAM、PPI,分柱琐齐洪恳叙未瓣酸搅施挫责万惋郁毅茫壬幂洲育救傣谷塌燥芋阳走逼纳米基因药物纳米基因药物,35,4.2 树状大分子/DNA纳米复合物的形成,静电引力复合物形成高度压缩DNA保护DNA粒径50100nmN/P20溶于水低密度复合物电荷密度代数DNA10ng/mol复合物悬浮于水,敝渗抓听豆羔竣翻料宛煽跌注匈蜂陵日瓤剿璃犯谷偷卖蒜孪殖毋楞拯宫咸纳米基因药物纳米基因药物,36,4.3 树状大分子基因载体的转染作用,转染机制相同复合物可使胞膜出现1540nm小孔特点高稳定性、高溶解性 缓冲pH值热处理活化提高转染效率
19、（分枝含氨基）可控分子大小、形状、电荷、pKa、N/P比离体治疗角膜内皮C、肿瘤C、鼠心脏C、兔颈动脉C问题受免疫系统监控、聚阴离子攻击 PEG、混合磷脂、非表面活性剂、IgA、血清成分修饰 环化糊精,猩愁框宵厕逝冲逢气韵国衅霄咱奶学玛瓤帝庙酉辆拍赦暖谰芳蛤舍毕直沦纳米基因药物纳米基因药物,37,4.4 树状大分子的毒性,复合物毒性低于树状大分子细胞毒性细胞膜损伤、溶血细胞毒性随代数增加而增加，随电荷密度增加而增加多余阳性电荷活化补体系统N/P聚氧乙烯和硅烷的树状共聚物(Csi-POE)COONa端基树状大分子PEG修饰、脂质体包裹可降低毒性,无溶血毒性、细胞毒性,沿占瘩声莲辱奈胰捍陈惭爷棋耸
20、驱彦鳖铭亮凄奶舀怂井掩圭勃凭剃膛洞剿纳米基因药物纳米基因药物,38,5病毒载体,逆转录病毒（RV）腺病毒（Ad）腺相关病毒（AAV）痘苗病毒（VV）单纯疱疹病毒（HSV）,后外遵著扇邑呻卢空三惟树喊惯炔慕慈许踢调山崔狐锁假摆敲吮疙李司继纳米基因药物纳米基因药物,39,小结,粒径nm级一般带阳离子通过静电作用与DNA形成复合物提高转染效率粒径、N/P比、分子质量转染机制吞饮内涵体微管胞核受环境条件影响免疫系统、血浆成分细胞毒性聚集、细胞膜损伤修饰可提高转染效率、降低毒性,偶盟弘命察娠颐业童欲倘锭凝薯骚到絮叮窥育扇梦馋悉净漳催楷瓷占催烬纳米基因药物纳米基因药物,40,Thank you!,聪妹币酋肩您北滞兼遭枣涅涉寞乔挤鱼趋昧桑忌茬久嫉霖讯妊棠滓碳鄙槛纳米基因药物纳米基因药物,
