细胞损伤与保护实验二.ppt

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1、细胞损伤与保护实验(二),设3组不同的细胞组 正常、损伤、损伤恢复用不同的实验方法检测、验证实验结果,实验内容,细胞电子显微镜检测细胞活率测定亚细胞结构的分离与鉴定,实验设计,昨天细胞传代:1.(电镜)中午每班传细胞入含小盖片培养瓶3瓶 晚上1瓶正常、2瓶损伤 次日损伤2瓶中,其中1瓶损伤恢复2.(活率)中午每组传细胞入96孔培养板9孔 晚上3孔正常、6孔损伤 次日损伤6孔中,其中3孔损伤恢复3.(分离)每组传代细胞(1传2)25ml培养瓶2瓶,细胞电子显微镜检测,细胞电镜标本制备,原 理,光学显微镜无法看清小于0.2um的细微结构,我们把这些细微结构称为亚显微结构(submicroscopi

2、c structures)或超微结构(ultramicroscopic structures;ultrastructures)。要看清这些结构,就必须选择波长更短的光源,以提高显微镜的分辨率。,电子显微镜与光学显微镜 的结构,从原理上来说是相似 的,但也有不同之处。,首先不同的是用电子束(电子流)代替照明光源。其次,电镜使用的是电子透镜,而不是光学透镜,电子透镜不是肉眼可见的物质透镜,它是由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间来起到透镜的作用。第三个区别是成像原理不同。其成像是由于标本中不同结构中原子与电子发生碰撞后,造成电子散射角度不同,使荧光屏上的电子强度也相应不同。,电镜制样技术,由于电子

3、束的穿透能力有限,为了获得较高分辨率,需要使用超薄切片机制成厚度一般仅为4050nm的超薄切片。这就需要样品有一定的刚性和韧性,为此,样品需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构,因此超薄切片样品制备的第一步就是固定,其后依次是包埋、切片和染色。,超薄切片的制备,1、固定:四氧化锇(OsO4)和戊二 醛等,四氧化锇进行后固定。2、包埋:环氧树脂和丙烯酸树脂等。3、切片:玻璃刀用超薄切片机切片,厚度4050nm,切片收集在 铜网或镍网上,在电镜下观察。4、染色:常用的染色液是醋酸双氧铀(易 染核 酸)和铅盐(易染蛋白质)。,结 果,在电子显微镜下观察 比对正常、损伤及损伤后恢复标本照

4、相分析总结,要 求,送标本照片结果分析,细胞活率测定,MTT比色法,原理,四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝MTT)是一种能接受原子的染料。可透过细胞膜进入细胞内。活细胞线立体中琥珀酸脱氢酶,能使外源性淡黄色的(MTT)还原成难溶于水的结晶,并沉淀在细胞中。其形成量与活性呈正相关。该结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解,用酶联免疫检测仪,在波长492nm测定其光吸收值。可间接反映活细胞的数量变化。,器材与试剂,器材:培养细胞(96孔细胞培养板)酶标仪、移液抢、抢头等试剂:5mg/ml MTT溶液二甲亚砜(DMSO)溶液 DMEM培养液(高糖、无糖),实验步骤,1、接种1.5104/ml细胞于96孔板:每组

5、9孔2、每孔加200ul培养液:3孔正常(高糖)、3孔损伤(无糖)、3孔损伤恢复(无糖 有糖),37oC、5%CO2、饱和湿度下培养;4、测定前2h,每孔吸弃原培养液,加高糖培养 液180ul、再加 MTT溶液20ul,继续培养;5、到2h测定时,每孔吸弃培养液,加DMSO 溶液150ul,振荡1分钟;6、酶标仪492nm波长处比色。,12h,结果,活细胞被染成紫色,而死细胞不被染色记录酶标仪上光吸收值,记录结果分析每组细胞生长情况,注意事项,每孔的细胞密度不能超出1x105/ml,避免影响实验的区分度;高浓度血清会导致实验本底增高,比色前尽量使血清浓度不超过10%。,亚细胞结构的分离与鉴定,

6、细胞核的提取,原 理,细胞内各种细胞器质量不同,在同一离心场内的沉降速度也不相同。根据这一原理,常用差速离心法、密度梯度离心法来分离各种细胞器。分离的各种细胞器可以用组化等方法加以鉴定。,器材与试剂,培养细胞离心机、天平、离心管、显微镜、滴管等、染色缸消化液、0.075M KCl、0.25%蔗糖溶液、甲醇固定液、Giemsa染液,操 作,收集细胞(消化法)离心(1000/min5)沉淀加0.075M KCl 4ml,冲打,静置20min离心(1500/min10)取沉淀加蔗糖溶液4ml,打匀离心(2500/min10)取沉淀加少量固定液涂片酒精灯烤干甲醇固定5 Giemsa染色5 自来水冲洗吸水纸吸干玻片(反面)显微镜10倍或40倍下观察(鉴定),结 果,细胞核染成深兰色,注意事项,注意正确使用离心机(平衡、对称)正确使用显微镜PBS使用液临用前稀释(PBS:Gimsa原液9:1),back,告 知,实验(三)凋亡相关基因在不同细胞中表达差异检测(免疫组化法)时间:10月25日,

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