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1、免疫组织化学技术 Immunohistochemistry techniques,第一节 免疫组织化学 技术概述,（一）发展简史,1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。60年代Nakane建立酶标抗体技术运用铁蛋白标记Ab技术70、80年代多位科学家改良上述技术，建立辣根过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）技术,抗生物素生物素（ABC）法使免疫组织化学进入了应用阶段。,2000年以后各种免疫组化技术更加成熟,使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。,定义:是应
2、用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记，在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。,（二）免疫组织化学的原理,抗原是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应
3、答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性,病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行预防接种，可以提高人的免疫力。嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤中心存在着与病毒密切相关的抗原。同种异体抗原动物免疫血清,与人类有关的抗原,抗体（antibody）指机体的免疫系统在抗原刺
4、激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。,世界著名抗体公司,Santa公司、Abcam公司、Abgent公司、Proteintech Group、Cell Signaling Technology（CST）、罗氏公司（Roche）,它借助于荧光素、酶等标记抗体与组织切片或细胞涂片中相关抗原相结合，由于荧光素所发荧光可用荧光显微镜检出，而酶可经一定的显色处理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准确定位欲测定的抗原物质。,标记物,荧光素、酶,标记,抗 体,抗 原,荧光,阳性色彩,显微镜观察,三大系统 本技术是应用免疫学原理来识别待测抗原，再通过酶和底
5、物的作用外加显色剂，将上述反应显示出来。,免疫组织化学,识别系统,联结系统,显示系统,识别系统是指特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特异性结合是本技术的基本依据。,联结系统由联结抗体构成。它的作用是联接识别系统和显示系统。,显示系统的目的是使抗原抗体间的特异性结合变为肉眼可见。因此显示系统由标记酶，底物和显色剂组成，以在靶抗原存在位点上形成有色沉淀。,特点：特异性强灵敏度高定位准确和简便快速等优点又能够将形态、功能及代谢的研究有机结合起来。,IHC方法,1 过去用过的方法ABC法，SP法。三步法，使用生物素2 目前最常用的方法二步法：EnliVision显色系统（即用型非生物素免疫
6、组化EnliVisionTM plus检测试剂盒）将多个抗鼠和抗兔的IgG分子二抗与辣根过氧化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大分子多聚体（polymer），直接放大信号40-50倍。敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。,3 最新一代的免疫组化 Novolink Polymer法：使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻碍，比传统中的大分子聚合物染色更显著），信号放大更强，还可以检测到组织中低浓度的抗原。,IHC方法,EnliVision法的工作程序：切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸，APES）H2O2处理（阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗组织切片的预
7、处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化暴露出抗原决定簇），TBS漂洗内源性过氧化物酶的阻断一抗孵育，TBS漂洗二抗孵育，TBS漂洗DAB显色，蒸馏水中止反应苏木素复染及封片,IHC技术的基本操作流程,切片,烤片,脱蜡水化,H2O2处理,热修复,一抗,二抗Enlivision试剂,DAB显色,苏木素复染,IHC染色结果的判读原则,玻片干燥造成的“边缘效应”,假阳性,未阻止内源性过氧化物酶,阻止内源性过氧化物酶后,I.注意影响IHC结果判读的因素,酒精固定,福尔马林固定,胰腺，insulin,平滑肌肉瘤，SMA,气泡影响抗体抗体反应,假阴性：注意内对照,假阴性,蛋白酶处理后,蛋白酶未处理,皮肤，IV
8、胶原,甲状旁腺，PTH,微波未处理,微波处理后,II.染色的特异性判定,Fujita Health University School of Medicine,Mitochondoria,Apicalmembrane,Basolateral membrane,Plasma Membrane+PERGolgi,Plasma membrane,PER+Golgi,Golgiapparatus,Endocrinegranule,Endocrine granuleLysosome,Cytosol,Nucleus,Cytoskeleton,amylase lysozome PAcP,S-100 NSE
9、prefixation diffusion artifact,CEA EMA ALPCD10,cytochrome P-450,immunogloblin AFP HCG factor-RA prolactin in activated pituicyte,SC EGFRE-cad,Leu 4 HLA-DR CEA,EMA,SC,CA19-9 in cancer cell,Leu 1 LCA PALP in seminoma cellCerb-B2,SC,AFP EMA,immunoglobulin in special conditions,chromogranin A serotonin
10、Peptide hormone,DNA polymerase S-100(occasional)estrogen receptor,keratin in carcinoid,mesothelioma vimentin,keratin in adenocarcinoma hepatocyte actin,keratin vimentin GFAP tubulin,各抗原在细胞内的显色方式,细胞膜阳性,细胞粘附分子：E-cadherin、CD31、CD56等交联膜蛋白分子：catenin、dystrophin 等细胞表面受体：EGFR、c-erbB2、c-kit/CD117（酪氨酸激酶受体）等绝大
11、多数白细胞抗原:LCA、CD20、CD2、CD5等表面或跨膜蛋白：Villin、BerEP4、EMA、CEA、CA125、EBV-LMP1等,细胞核阳性,细胞周期素蛋白：cyclins、cyclin 依赖激酶(cdk)、cdk 抑制剂(如 p16)等细胞增殖相关蛋白：Ki67、PCNA转录因子：MyoD1、myogenin、TTF-1、CDX2、PAX5肿瘤抑制基因：如 p53、p63、Rb、WT1基因错配产物：如 MLH1、MSH2,细胞核酶：如 TdT类固醇激素受体：如 ER、PR、AR细胞核钙结合蛋白：如 S100蛋白、calretinin定位细胞核的病毒：如 CMV、HBcAg（核+核
12、周）NeuN：neuronal nuclei，表达于成熟的神经元,细胞浆内颗粒状阳性-定位于细胞器,溶酶体颗粒：如 lysozyme、CD68、myeloperoxidase黑色素小体和前黑色素小体：如 HMB45、Melan-A细胞毒颗粒：如TIA-1、granzyme B线粒体:如抗线粒体抗体,HEP-PAR1神经内分泌颗粒：各种激素（如PTH、ACTH、insulin）、CgA、SynW-P 小体:F-VIII相关抗原分泌颗粒：如BRST-2、surfactant、PSA细胞内微生物：如弓形虫,细胞浆纤维状阳性-中间丝或微丝,中间丝;CK;Vimentin;DesminGFAP（glia
13、l fibrillary acidic protein，胶质纤维酸性蛋白）NF（Neurofilament，神经元胞浆节细胞神经瘤，副节瘤/嗜铬细胞瘤，神经母细胞瘤）Nestin：巢蛋白，神经前体细胞,弥漫或片状的细胞浆阳性,蛋白分布在细胞内液、大量的微囊及内质网中如:myoglobin、hemoglobin、albumin、AFP、NSE、cytoplasmic Ig、CD3病毒颗粒/蛋白如:HBsAg（常在核旁着色）从细胞间液吸收的蛋白如:Ig、albumin,分化差恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断；证实内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤；应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤，如癌胚抗原（CEA）对胃肠道癌、甲
14、胎蛋白（AFP）对肝癌和卵巢内胚窦癌诊断有帮助；,（三）免疫组化的应用,有时可帮助确定肿瘤的良恶性，如应用免疫球蛋白轻链和来鉴别滤泡性恶性淋巴瘤和滤泡性反应性增生；研究某些癌症与病毒的关系，如肝癌与乙型肝炎病毒、鼻咽癌与EB病毒、宫颈癌与乳头状瘤病毒等的关系；,为肿瘤治疗的选择提供依据，如乳腺癌检测雌、孕激素受体（ER、PR）呈阳性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗可预期获得较好的疗效；检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如c-erbB2，p53）、增生活性抗原（如Ki-67，PCNA）用来估计肿瘤的预后。,免疫组化在临床诊断中 应用病例示范（Case 1）,临床病史资料：48岁，男性，胃活检标本取自
15、胃大弯部位。H&E染色切片描述肿瘤细胞显示在间质中呈癌巢样，邻近的腺体肠上皮化生，间质中的不规则的巢状结构待诊断.,H&E染色,第二节 免疫组织化学染色前的基本技术,(一)样品的取材,组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。,细胞标本后者包括组织印片和细胞涂片。,其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究.,样品制备的第一步就是取材，取材的好坏关系到实验的结果。所以必须做好准备工作。现将组织取材的原则和具体要求分述如下：1 刀剪锐利、洁净。2 快速、准确、尽量保持生活状态，力争1分钟之内放
16、入固定液，最迟不能超 过3分钟。,3 一刀切取，切取应在蜡版或滤纸上进 行，避免拉锯、牵拉或挤压等动作。4 低温操作，防止自溶现象，通常以 0-4的低温条件下操作为佳。,5、样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内，免疫组织化学样品大约在：2cm1.5cm0.3cm厚度控制在0.3cm。电镜样品规格要求切成共3小块。,对病理组织取材还应做到以下几点：取材部位必须是主要病变区；必须取病灶与正常组织的交界区；必要时取远离病灶的正常组织做对照。,细胞标本的取材,印片法:常用于活检标本沉淀法:主要用于胸水、腹水、尿液等穿刺抽吸法：常用于淋巴结、软组织、肾、肝、肺等组织。,注意事项：细胞经离心后细胞粘
17、附性较差，标记过程中容易脱片，载玻片应涂粘附剂细胞总数应以105个为宜，并集中在直径的圆圈内。富于粘液的标本，未经处理不宜作免疫组化标记。,（二）、组织固定,2、免疫组化标本固定时，好的固定剂应 满足哪些要求？,1、目的:固有形态和结构、抗原完整性,能快速固定抗原；防止抗原物质扩散；固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应。,甲醛固定液：分类较多，最常用的4%多聚甲醛固定液，对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；主要特点：组织穿透性好，收缩性小但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。,3、各种固定液：,Bouin,S
18、固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。,（三）、组织脱水浸蜡及包埋,脱水透明等过程需在4或室温下进行，避免组织抗原的损失；为使组织充分脱水、透明和浸蜡，组织块的厚度以为宜;浸蜡及包埋过程中,石蜡温度应保持在60或60以下,用熔点低的石蜡包埋;制备蜡块在较低的温度进行,故试剂处理时应适当延长,否则会给切片带来困难,常用的包埋法,石蜡包埋冰冻干燥包埋塑
19、料包埋,（四）组织切片中载玻片的处理,抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用Poly-L-Lysine、ZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 等几种试剂，对已常规清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：,Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。,（五）抗原修复,抗原修复是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面
20、活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。,石蜡切片为什么要做抗原修复？有那些方法？,石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽.所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。,常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。,抗原修复方法,一、热修复 1、微波炉加热法 将玻片分别插入抗原修复盒中，以保证各部
21、位的玻片受热均匀。在抗原修复盒中加入抗原修复液，盖上带有小孔的盖子。将塑料盒置于微波炉中央，加热 2x5min。两次加热之间，加入 50ml 蒸馏水。加热过程中，组织标本不可干燥。,在压力锅中放入 1500-3000ml 抗原修复缓冲液加热到沸腾，不加阀，玻片插入切片架并放入沸腾的修复缓冲液中。后加阀，使之加压2分钟。后将压力锅置于流水槽或继续冷却 20 分钟（减压）。取出切片，蒸馏水冲洗，移至 TBS 或 PBS 液中，以避免组织干燥。以下同微波炉修复法。,2、压力锅法,抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复
22、方法。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、F等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。,二、酶消化方法,1、胰蛋白酶处理：A 滴加一滴胰蛋白酶工作液于组织上。B 室温 37 孵育 20-40 分钟，孵育时间的长短依福尔马林固定时间及所测抗原情况而定。C 蒸馏水冲洗，终止反应。D 阻断内源性过氧化物酶。E 免疫组化染色。,2、胃蛋白酶处理 A 滴加胃蛋白酶工作液于组织上。B 最佳消化时间取决于福尔马林的固定时间，37 预热。一般消化 10 分钟，长至 30 分钟。C 以下同胰蛋白酶处理方法 3,4,5。注：过度消化将导致组织结构的丢失，并引起组织脱片,三、综合方
23、法,微波炉加胰酶修复法：将组织切片置于盛有 50ml 修复液的塑料盒中，封口膜封口后加热 5 分钟。冷却后打开，将切片置于 37 预热的蒸馏水中，胰蛋白酶消化。室温胰蛋白酶处理 30 秒钟。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶，置蒸馏水中。免疫组化染色。,操作中还应注意如下问题：,1、热处理后应注意自然冷却。2、热处理时要防止切片干燥。3、应根据不同的抗体选择合适的抗原修复方法。4、一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。,5、注意形态学结构的改变(一般经高温修复后胞浆会无明显的破坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但核破坏较轻)
24、。6、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA等可改善某些抗原的修复。,免疫组化操作经验和体会,操作中应注意以下问题：1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。3.PBS洗涤要充分。4.要设阴性和阳性对照。5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。,6.消除内源性生物素活性：预先以0.01%抗生物素溶液作用切片20min。7.ABC复合物应在临用前30min配置。8.ABC试剂保存温度以4 为佳，保存达数年仍可获满意效果。9.抗体保存：-20 分装冻存，或于4 常规使
25、用，切忌反复冻融。,免疫组化染色方法选择的原则,要根据需要证明的抗原的种类、标本中的抗原保存情况、来选择最佳的方法。简单来说，就是五个“S”。首先是“specificity”，即特异性。例如，要证明组织中的细胞角蛋白以区分来源于上皮的癌和来源于间叶组织的肉瘤，可选用多克隆的抗角蛋白抗体，其特异性较广；而要区分来源于鳞状上皮鳞癌和来源于腺上皮的腺癌，则应选用特异性更高的抗角蛋白不同家族成分的单克隆抗体。,第三是“simplicity”，简便性。在达到要求的前提下，越简单的方法，越能节约时间和经费。如能用PAP法就不要用ABPAP法。,其次是“sentivity”，即敏感性。敏感性高，则特异性下降，假阳性增加；反之，敏感性低，则特异性升高，假阴性升高。,第五是“save of time and money”，即省时省钱。实际上与第二条简便性相似。简单的方法一般省时省钱。总之，在方法的选择上，最为重要的是特异性。其他的条件要在满足特异性后才考虑。,第四是“safe”，安全性。免疫组化操作要使用DAB、酸、碱、二甲苯、过氧化氢等有害物质。不仅对操作者有一定的危害，对环境也有一定的污染。在选用方法时，如果条件允许，应尽量用对人体危害小的方法，如用AP标记抗体。,
