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1、2023年DNA甲基化与宫颈癌临床应用趋势与挑战（全文）摘要依据现行宫颈癌筛查策略与世界卫生组织宫颈癌筛查指南，未来会考虑将基因甲基化纳入新的指南。然而，关于DNA甲基化检测在宫颈癌的具体临床应用价值还有待讨论。本文回顾了DNA甲基化在宫颈癌发生过程中的作用,并讨论了甲基化检测在高危型人乳头瘤病毒（hrHPV）阳性女性管理中的潜在临床应用。认为甲基化检测不仅可用于hrHPV阳性女性的初步分流；还可用于轻微细胞学异常女性的二级分流，以确定宫颈上皮内瘤变3级（QN3）或癌的高风险；同时也可用于即将终止宫颈癌筛查规划者的辅助检测，为CIN的管理提供支持。宫颈癌是一种严重威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤
2、，其发生率仅次于乳腺癌，位于女性癌症相关死亡因素的第4位1,2O2020年全球大约有60.4万宫颈癌新发病例及34.2万的死亡病例，其中88.1%的新发病例和91.4%的死亡病例发生在中低等收入国家1o为了进一步降低全球宫颈癌的疾病负担，世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO）于2018年启动了全球消除宫颈癌的行动，并在2020年发布加速消除宫颈癌全球战略，明确了在2030年达到人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）疫苗接种、宫颈癌筛查及治疗的阶段性目标,迄今已获得超过194个国家及地区的支持2JO根据流行病学的统计，中国作为全球宫颈癌负担
3、最重的国家之一，2020年我国新增宫颈癌病例数达到10.9万、死亡达到5.9万例，当前我国宫颈癌的发病及死亡情况仍呈现上升状态3Jo宫颈癌患者的5年总体生存率为68%,而复发或转移性宫颈癌患者的生存率仍然较差，仅有17%4,5O若能对宫颈癌前病变及早期浸润癌进行及时有效的诊治和管理，可以降低复发或转移性宫颈癌发病率并提高患者生存率6o因此，在当前的临床诊疗的技术应用上，仍需要可靠的方法对宫颈癌进行早期诊断与治疗。宫颈病变与宫颈癌的早期诊断与治疗主要通过女性宫颈癌筛查来实现，宫颈细胞学检查、HPVDNA检测、醋酸与复方碘液染色肉眼观察(ViSUalinspectionwithaceticacid
4、/visualinspectionwithIogolsiodine,VIA/VILI)等是目前主流的方法。我国于2005年制定了首个中国癌症筛查及早诊早治技术指南并于2017年8月中华预防医学会女性保健分会发布了宫颈癌综合防控指南，其作为国内宫颈癌筛查主要指南，指出宫颈细胞学检查和HPVDNA检测是目前我国最主要的筛查技术。一、宫颈细胞学检查宫颈细胞学检查是当前应用较广泛的技术，发达国家或地区因宫颈细胞学筛查项目的实施，宫颈癌的发病率和死亡率已显著降低7o然而，从临床实践的角度来看，尽管细胞学检查技术可以筛查出大部分宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasi
5、a,CIN),但由于细胞学检测结果的判读主要取决于细胞病理师的经验和技术，这一技术对于发展中国家或者基层地区的普及仍相对困难8o过往的研究数据表明，细胞学检查中有超过30%的QN2、CIN3和浸润性癌难以区分,并可能导致临床过度诊疗或造成女性的过度焦虑，尤其对于育龄年轻女性，可能导致失去生育的机会9,10o二、HPVDNA检测HPV是一种传染性致癌病毒，目前已知的HPV亚型超过120种，主要感染宫颈、肛门或口咽部的上皮细胞，从而可能导致组织病变和癌症11o根据目前的研究结果，几乎所有的宫颈癌组织活检结果皆显示HPV感染12OWHO根据HPV致癌风险，将14种高危型HPV病毒（HPVl6、18、
6、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）作为宫颈癌筛查的主要目标型别，其中超过70%的宫颈癌与HPVI6和HPVl8感染有关13,14,因止匕，HPVDNA检测是目前最广泛用于筛查和随访监测的技术之一。然而，HPV检测的高灵敏度和有限的特异度仍无法区分短暂自限性的感染和可能发展为肿瘤性病变的持续感染，同时还可能会产生相对于细胞学检查更多的假阳性结果，导致患者恐慌15o因此，当HPVDNA检测结果呈阳性时，不一定表明癌前病变或癌症的存在。目前对于HPV筛查后的挑战，将围绕在HPV阳性患者的管理和随访，以防止宫颈癌前病变或癌的发展16O现有的多项指南和共识认为，作为
7、主要筛查的HPV检测应该伴随着具有高度特异度的分流检测，以减少额外检查（如阴道镜检查）的建议17o尽管高危型人乳头瘤病毒(high-riskhumanpapillomavirus,hrHPV)是导致高级别鳞状上皮内病变(high-gradesquamousintraepitheliallesion,HSIL)的主要病因，然而,并非所有感染hrHPV的患者皆会进展为宫颈癌,这也是导致HPVDNA检测特异度低的原因之一，hrHPV阳性且高级别细胞学结果的女性中,检测HSIL的阳性预测值(positivepredictivevalue,PPV)为94%,但在hrHPV阳性且低级别细胞学结果的女性中，
8、PPV降到16%18,这说明HPV检测可能无法区分持续性和一过性感染。由于90%hrHPV感染能在12年内自动清除，因此如何区分持续性和一过性感染的女性，避免对阳性者造成不必要的恐慌，是HPVDNA检测作为宫颈癌筛查技术面临的难题19o迄今为止，细胞学和HPVDNA检测都不能作为初筛技术同时提供足够的特异度和敏感度。因此，迫切需要在无创或微创采样的背景下，寻找基于客观、易判读、高灵敏及具有高特异度的早筛或辅助诊断的新型生物标志物和技术，用于评估CIN2/CIN3发展为侵袭性癌的风险，进行随访管理20o三、DNA甲基化技术DNA甲基化是一种化学修饰方式，通过DNA甲基转移酶(DNAmethylt
9、ransferasezDNMT)的作用使胞口密咤的第五号碳原子发生甲基化，从而产生5-甲基胞嚓咤(5-methylcytosineSmCDNA甲基化、组蛋白修饰与非编码RNA,均是表观遗传调控的主要机制21o研究表明，甲基化变化会对肿瘤的发生和其他疾病的复杂发病机制产生重要影响，在肿瘤发生过程中，参与预防肿瘤变化调控细胞周期、DNA修复和凋亡等关键途径的基因启动子上通常会观察到异常的高甲基化22o甲基化高表达会通过阻止转录因子的结合或染色质局部结合位置的变化来达到转录抑制，进而导致基因沉默23O因此，DNA甲基化的变化被认为是肿瘤或者疾病辅助诊断的生物标志物24o目前的研究主要集中在探讨抑癌基
10、因启动子CpG的高甲基化改变,并认为通过特定DNA甲基化位点的水平检测可以用于肿瘤的早期诊断、预后预测和治疗评估25,26oDNA甲基化具有多种特征使其成为可用于癌症早期诊断的有效生物标志物。通过荧光定量聚合酶链式反应、二代测序或芯片等临床成熟技术进行检测，即可得知癌症或病变的快速进展的结果，DNA甲基化于体液、细胞与组织类型中稳定存在并具有高特异性24o因此,检测临床样本DNA甲基化模式和甲基化水平的改变，对于开展癌症早期诊断、治疗和预后具有重要价值。目前，DNA甲基化已成为临床上多种癌症早期诊断的生物标记物和预后评估指标。国内外许多研究机构和公司已在结直肠癌271肺癌28L前列腺癌29,3
11、0等多个癌症中，开发出成熟的体外诊断试剂，并陆续获得国家医疗器械三类证书，初步应用于临床辅助诊断实践。但目前仍需进一步研究和验证甲基化变化在肿瘤发生过程中的机制，以及基于真实世界的前瞻性、多中心的大规模临床试验。1 .DNA甲基化与宫颈癌发生：高危型HPV感染上皮细胞后,其DNA能整合到细胞基因组中。由于E2基因表达障碍，不能有效抑制E6和E7基因转录，导致E6和E72种癌蛋白持续高表达。在转录过程中，E6和E7与分化上皮细胞中的多种细胞蛋白相互作用，同时病毒染色质发生遗传重塑（包含组蛋白的修饰和DNA的甲基化水平改变）31,导致染色体DNA合成不稳定,影响细胞分化周期并诱发上皮细胞癌化32,
12、进一步加剧的富含CpG启动子区域的局部高甲基化也会加剧肿瘤抑制基因沉默,促进癌症发展33z340目前，已发现许多特定基因的DNA甲基化与宫颈癌的发病机制和进展相关，例如PAX1、JAM3、EPB41L3xZNF582、SoX1、FAMl9A4和miR124-2等35,36,37,38Jo研究表明,DNA甲基化的改变可能比组织病理改变发生得更早，甚至可能在中低级别上皮内病变（IOW-gradesquamousintraepitheliallesion,LSIL）时就出现,在HSIL及癌中具高度甲基化结果这表明特定基因DNA甲基化水平的改变具有预测癌变进展的可能性。在一项基线未确诊宫颈癌的452例
13、hrHPV阳性女性中进行了随访研究结果显示PAXl甲基化阳性或细胞学HSIL+的QN3+发生率明显高于PAX1甲基化阴性或无细胞学HSlL+的女性。这表明PAX1甲基化检测是一种有效的分子标志物，可用于预测疾病的进展39o另一项关于甲基化结果预测临床CIN2/3的消退率的研究结果显示，FAM19A4miR124-2甲基化基线结果阴性比甲基化阳性（74.7%比51.4%）的女性显示出更高的临床消退率40O因此，DNA甲基化检测在宫颈癌早期诊断中可以预测宫颈病变进展与消退，弥补现有技术的不足。2 .甲基化技术应用于hrHPV阳性女性的分层管理：对于hrHPV初筛阳性的女性，需要进一步进行分流，以减
14、少一过性HPV感染导致的过度诊疗与恐慌。HPV阳性妇女二级分流诊断工具的选择，需兼顾高灵敏度、高特异度以及降低患者诊疗负担。目前临床上常使用的分流方法包含细胞学、HPV16/18基因分型和重复hrHPV检测。但这些技术在实际临床实践中仍存在一些困难，例如需要依赖专家经验对细胞学结果进行评估或需要建立重复检测的体系41o甲基化检测技术被认为是hrHPV阳性患者分流的一个替代方案，其主要优点具有客观性、高重复性和一致性42o根据前期的研究，使用单一基因POU4F3与6基因组合（DLX1、ITGA4、RXFP3、S0X17sZNF671及ASTNl）进行甲基化检测，其对于QN3+敏感度/特异度分别为
15、89.6%60.9%和（64.5%76.2%/（76.0%94.6%）43,44f45o而在亚洲人群中,关于PAX1基因甲基化在宫颈癌诊断中的应用，已展开多项研究。单独使用PAX1基因对于hrHPV阳性女性的CIN3+的检测性能为：敏感度71.15%76.9%及特异度80.17%91.6%39,46o同时，将PAX1与其他基因联合可以增加甲基化在hrHPV阳性分流中的敏感度与特异度,这也是目前临床研究的重点发展方向47z48,49o上述这些研究提示，通过检测特定宫颈癌基因甲基化可作为对于hrHPV的分流技术。3 .甲基化技术应用于细胞学异常女性的分层管理：目前，宫颈癌筛查的主要方法包括宫颈细胞
16、学，hrHPV检测以及细胞学和hrHPV检测相结合。在筛查人群中，约90%的筛查结果为正常，约0.75%是为严重异常。其他为轻微异常，包括hrHPV阳性且细胞学结果正常,不典型鳞状细胞(atypicalsquamouscellsofundeterminedsignificance,ASC-US)和LSILo对于轻微异常，尚不清楚下一步是否应该进行阴道镜检查以防止漏诊高级别病变及宫颈癌或者是随访50o研究表明ZNF582结合HPV16/18可作为细胞学为ASC-US的分层管理,其中一项为阳性结果可将敏感度提高至89.19%,二者均为阳性者特异度94.64%51o欧洲的多中心研究表明52,使用FA
17、M19A4miR124-2甲基化技术对细胞学ASC-US的hrHPV阳性女性进行分流,可以最大限度减少诊断CIN3所需的转诊次数。以上数据表明，甲基化检测的分析将有助于对hrHPV阳性或细胞学检查异常的女性区分，以判断是立即进行阴道镜检查或持续随访。4 .甲基化技术应用于终止宫颈癌筛查的辅助检测：大多数国家或地区仅针对60或65岁以下的女性实施宫颈癌筛查规划。我国2017年宫颈癌综合防控指南53中建议，对于年龄超过65岁的女性，若过去10年筛查结果一直为阴性(即每3年筛查1次，连续3次细胞学检查均无异常，或每5年1次，连续2次的HPV-细胞学联合筛查结果阴性)，且无CIN病史，则可以终止筛查。
18、然而，在部分筛查适龄外的高龄女性中，仍存在患病风险。由于高龄女性具有较低的hrHPV转阴率,而生理结构改变可能导致细胞学检测的灵敏度降低，因此在hrHPV检测或细胞学分诊检测时可能存在漏诊54,55o甲基化检测技术因其高灵敏度及特异度，在部分研究中可应用于女性终止宫颈癌筛查规划前的末次检测。在甲基化检测结合hrHPVDNA检测的结果中二者均为阴性将有助于减少漏诊的可能，而任一指标呈现阳性时，则推荐进一步进行阴道镜检查56o四、小结宫颈癌是妇科疾病中十分常见的一种癌症，其发病率仅次于乳腺癌，且在我国女性中呈现上升趋势。目前临床应用的宫颈癌筛查指南尚存不足。因此,DNA甲基化检测可能成为一项重要的补充检测技术。甲基化是DNA上的一种修饰方式，通过对基因转录进行调控，影响基因表达。当DNA甲基化的原始模式发生改变时，可能导致抑癌的基因表达被关闭或原癌基因的表达被激活。因此，通过检测与癌症相关位点的DNA甲基化水平变化，可实现肿瘤早筛早诊的目的。DNA甲基化检测已在临床上应用于肠癌、肺癌、膀胱癌等的早癌筛查,今后或可用于hrHPV阳性女性的初步分类、作为细胞学异常的女性的二级分流以及作为妇女终止宫颈癌筛查计划的最后一轮辅助检测，以识别宫颈癌和晚期CIN,并支持CIN的管理。参考文献（略）
