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1、质粒DNA的小量提取及检测,把有用目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb 不等，为双链、闭合、环状DNA 分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活（自杀质粒 oriR6K/pir,oriTs）。质粒的
2、存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F 质粒(又称F 因子或性质粒)、R 质粒(抗药性因子)和Col 质粒(产大肠杆菌素因子)，以及产某些限制性内切酶与修饰酶等。,质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有1 个或几个质粒分子，如F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20 个以上，如Col E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA
3、 复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松驰型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20 多个扩增至1000-3000 个，此时质粒DNA 占总DNA 的含量可由原来的2%增加至40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性（Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。,质粒载体是
4、在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列（MCS），并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb 之间，如PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和pBluescript（简称pBS）等。,大多质
5、粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。,T7 promoter 311-327T7 transcription start 310T7 Tag coding sequence 207-239Multiple cloning sites(BamH I-Xho I)158-203HisTag coding sequence 140-157T7 terminator 26-72lacI coding sequence 714-1793pBR322 origin 3
6、227bla coding sequence 3988-4845f1 origin 4977-5432,从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3 个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠(SDS)可使细胞膜裂解，细菌染色体DNA 会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA 比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA 变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，
7、当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA 片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA 双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。,碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。,在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA 外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA 两条链中有一条
8、链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(Open circular DNA，简称 ocDNA)；如果质粒DNA 的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA 电泳时，同一质粒DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。,材料、设备及试剂,一、材料 含pUC19 的E.coli DH5菌株，1.5ml 塑料离心管(又称eppendorf 管),离心管架。二、设备 微量取液器(20l，200l，1000l)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置等。,三、试剂 1、L
9、B 液体培养基(Luria-Bertani)：蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract)5 g，NaCl 10 g 2、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成 50mg/ml 水溶液,-20保存备用。3、溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。高压灭菌15 分钟,储存于4冰箱。4、溶液：0.2 mol/L NaOH，1 SDS。5、溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+
10、3mol/L，Ac-5mol/L。6.NH4Ac 7.5M 7.70%无水乙醇 8、RNA 酶A 母液：将RNA 酶A 溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5),15mmol/L NaCl 中，配成10mg/ml的溶液，于100加热15 分钟,使混有的DNA 酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20。9、TE 缓冲液：10 mmo/L TrisCl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4冰箱中。10、电泳所用试剂：（1）TAE 缓冲液(50)：（2）上样缓冲液(6)：0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。,实
11、验 流 程,质粒DNA的提取接含pUC18的E.coli单菌落于2ml LB Amp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜（OD=1.0）用1.5ml离心管取1.5ml菌液，12000rpm、离心1min，弃上清,将管倒置于纸上,使液体流尽加100uL预冷的溶液I悬浮菌体（需剧烈振荡）加入200uL溶液II（现配现用），温和颠倒eppendorf 管数次,以混匀内容物（溶液变清澈透明）加入150uL预冷的溶液III，温和颠倒eppendorf 管数次,使沉淀混匀，冰上静置5min质粒DNA复性（明显的白色沉淀）加一滴氯仿，12000rpm，4 离心5min取上清液移入干净eppend
12、orf 管中,加250ul NH4Ac，混匀，12000rpm，4 离心5min取上清液移入干净eppendorf 管中,加1ml 无水乙醇混匀，-20度 20min沉淀DNA12000rpm，4 离心10min小心弃去上清，将管口敞开倒置于纸上使所有液体流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次，沉淀超净台中风干将沉淀溶于20l TE 缓冲液(pH8.0，含20g/ml RNaseA)中，储于-20冰箱中,注意 1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3.沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用异丙醇(一般使用0.6V体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。,质粒DNA的电泳鉴定0.75%琼脂糖凝胶(用 TAE buffer配)1xTAE 1uL质粒DNA+1uL 10 xloading 5伏/cm恒压电泳，45min结果用凝胶成像仪分析照相,
