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1、体外放射分析,分类：1、竞争性：放射免疫分析RIA 竞争性蛋白结合分析CPBA 放射受体分析RRA 放射酶分析 放射微生物分析2、非竞争性：免疫放射分析IRMA,一、放射免疫分析RIA原理：P62 竞争机制：Ag(不定量)+Ab（有限量）固定量*Ag 免疫结合反应形成免疫复合物,定量分析的数学基础：免疫结合反应服从质量作用定律 P+Q=PQ PQ K=-PQ K值大表示亲和力大,由质量作用定律推导的数学模型 Q0 1 Q0B2B（1+-+-）+-=0 P0 KP0 P0 PQB=-100%P0=Ag+*Ag PQ=*AgAb P0Q0=Ab的初始含量当*Ag为固定量时，P0为自变量（实际为Ag
2、）P0与复合物B呈一定的函数关系,放免反应的定量依据：剂量反应曲线或叫标准曲线 剂量反应曲线的含义 以已知的标准品为横坐标，以放射性复合物测定值的某种表达式做纵坐标，绘制剂量-反应曲线 P64图41 P74图413,曲线的斜率是关键因素，斜率不同精密度不同（P64图41）斜率=tg（代表曲线或直线的倾斜度）影响斜率的常见因素有以下几点：1、Ab亲和力：K大，斜率也大 2、Ag用量：Ag少，斜率大 3、Ag的免疫活性：活性强，斜率大 4、*Ag的比活度和放化纯度：5、Ab用量：B=3350%斜率最大。6、反应条件和温度（见后）,免疫反应条件要求：1、PH：大多PH=7.52、离子强度：常用0.0
3、50.1M3、反应温度：实验确定,RIA方法学1、操作步骤：P1942、RIA的基本试剂标准抗原基本要求：标准抗原与待测物免疫性必须一致 必须高纯度：不纯不能制备抗体，不纯标记物放化纯度达不到要求 标准抗原的量必须准确：（用于标准曲线）具有良好的稳定性（能保证较长时间不改变性能）标准抗原的用途：制备抗体 制备*Ag 标准曲线,抗血清检查抗血清的指标：1、亲和常数K P192 2、交叉反应率 P193 3、滴度 标记抗原Ag*基本要求：免疫活性与待测物及标准品一致适度的比活度：太高、化学量少、不具竞争性，太低统计误差大。足够高的放化纯度（95%）,免疫活性检验：复合物放射性最大结合百分率（B%）
4、=-100%参与反应标记抗原放射性分离方法非特异分离法：吸附法（活性炭）层析电泳法 过滤法 磁性分离法 沉淀法（聚乙二醇，硫酸胺等）,特异分离法：双抗法 固相分离法 葡萄球菌A蛋白（SPA）补充：对分离方法的基本要求 1、使结合部分与游离部分尽可能完全分开 2、分离的成份便于放射性测量 3、分离效果不受外界干扰因素的影响 4、操作简便、分离迅速、重复性好 5、与游离标记物的非特异结合尽可能小 6、试剂来源广泛，经济价廉,RIA加样方法1、平衡法：三种反应物同时加样 优：简便易掌握 重现性好竞争反应较典型 缺：灵敏度不高2、顺序加样法：Ag+Ab温育后再加*Ag 优：标准曲线起始段斜率高、灵敏度
5、高 缺：曲线工作波度范围窄、重现性差3、一天法：（特殊情况下使用）,样品采集与保存应注意的几个问题 用原样品、新鲜样品、减少存放、最好不纯化、浓 缩萃取、减少变异 尽快做实验，避免反复冻融 尽可能少用添加剂等，抗凝剂也少用。,RIA数据处理的数学模型（补充概念）后页,放射免疫法的数学模型及处理常用符号及英文缩写的含意：NSB：非特异结合B0%：B0管的放射性测量值与加入总放之比。BQC：质控探样品测量值CPMBN：NSB管的样品测量值CPMF：游离物质样品测量值CPMB：结合的沉淀物样品测量值CPMED50：指B/B0为50%时对应剂量值。ED25、ED70 指 B/B0 为25%、70%所对
6、应的剂量。,曲线模型分类1、针对剂量反应的实际曲线模型：如多项式函数，光滑样条函数，线性内插模型2、直线化模型：（logit log模型）常用：将标准曲线横坐标各点取对数lgX而纵坐标用logit Bx/B0,logit Bx/B0=lg Bx/B0Bx 该直线法标准曲线的零点丢失（零无对数）造成灵敏度降低,3、logistic模型：只能用于平衡反应两点改进 a：横坐标不取对数而用 D b：不做NSB，靠计算机计算拟合扣除NSB。ad模型：Y=-+d x 1+(-)b c 有四个参数：a=B0（也称四参数logistic模型）c=ED50 b=logitlog直线斜率 d=NSB,4、五参lo
7、gistic数模型：abY=-+d x 1+(-)bE c引入了一个不对称因子E。E计算机能求出。可用于非平衡反应系统,5、四参数单位点质量作用定律模式：按质量作用定律导出的模式 优点：质量作用定律，稳健回归拟合；适于平衡和非平衡系统；个别坏点对曲线影响小。模型的选择（拟合优度法来选）问题：一组数据可用多种模型去处理，如何选用？线性拟合用最小二乘法，选残差平方和最小的模型。非线性拟合用百分比偏差DEV%DEV%=（XX）/X 100%DEV%10%即可使用。,放射免疫的质量控制RIA的误差来源：试剂（变性，核素脱落、贮存不当免疫活性等）样品（放置不当，存放条件不同，制备、采集的差异等）操作（加
8、样不准，反应条件改变、分离不统一等）仪器与设备（不统一，差异等）测量（统计涨落）数据处理：拟合不当、方法不一致等。,误差分类系统误差：原因是确定因素如试剂变性，称量不准，批号不同。随机误差：原因属偶然，难以确定，测量结果忽高忽低呈双向围某数值波动。过失误差：过失造成的误差，结果失真无规律性可查。质控目的：找出误差原因、采取必要措施，保证实验结果的可信性。质控分类 实验室内质控 实验室间质控,常用的质控指标：灵敏度、特异性、精密度、偏差、准确度、稳定性、临床有效性。1、灵敏度：10个B0管均值减去2SD后在标准曲线上查得的剂量值。2、特异性：用交叉反应率来表示3、精密度：同一样品多份测量结果变异
9、的大小。SD可用SD或CV=-100%X4、偏差：偏离真值的程度 测定值真值偏差b=-100%真值,5、准确度：测量值与真值的符合程度，也叫回收率 回收管测量值对照管测量值回收率=-100%回收管内加入的已知量反应准确度评价指标在空白样品中加入已知剂量的待测物得 测定值空白值 样品 回收率=-100%已知值回收率应在90110%之间,测定值真值 偏差=-100%真值 偏差允许在10%之内。注意：测定值应取高、中、低三个剂量区的样品分别求出高、中低三个剂量的回收率和偏差。,6、稳定性：指批间重复性。对曲线稳定性考核的常用指标有：ED25、ED50、ED75、B0%、NSB%等。不同批实验中这些值
10、应大体接近。7、临床有效性：阳性率与临床诊断的符合率。与正常值的确定有关。上述几种指标间的关系；靶图。若某点的CV%大于10%应做为坏点剔除。,反应精密度的几个指标（1、2、3）：1、平均批变异系数（ABCV）：指一批实验数据的CV平均值：SDABCV%=-100%X2、反应误差关系（RER）：指一批实验各复管的SD与其X之间的函数关系。SD为CPM的误差。它是反应实验复管平行性好坏的综合指标，不是剂量的误差。RER的计算公式见P85，423 RER0.04 优秀0.120.040.12 差,3、精密度图（P、P图）：以剂量lgD为横坐标，以各剂量复管的SD为纵坐标做的图。P、P图步骤：1）建
11、立剂量反应曲线2）计算各样品的放射性测量值X和误差SDR3）将放射性的X和SDR通过剂量反应曲线查得剂量D并计算D的SD即SD0，或换为SD0/D=CV%4）以LgD为横坐标：以CVD或SDD为纵坐标做图。,PP图的用途1）确定方法的灵敏度2）确定剂量反应曲线的有效工作范围3）评价RIA的最佳工作条件4）RIA的质控评价5）判断剔除坏点,3、健全性试验：指用标准品绘制的标准曲线与用不同释稀度病人样品绘制的曲线应平行。影响健全性的因素：a.标准品与待测物性质不同b.反应系统有干扰反应c.待测物在标准品确定的环境中不适宜。,4、youden图：在多批实验中每一实验测量的首部和尾部放置二个相同浓度的
12、质控样品，将其测量值求XSD。在直角坐标中，做图如下：QCH 首QCM QCLQC首 首样品2SD A B D 尾样品QC尾A区：准确区B区：正偏差区C区：负偏差区D区：不精密区意义：一种简便，直观、有效地评价精密度和偏倚的方法。,5、Cusum图：把每批实验的QC测定值与靶值相减后做图。评价：1）小斜线连续上升或下降提示有正、负偏差2）小斜线的斜率反映偏差的大小3）斜线两端点落差的绝对值超出QC的3SD说明有偏差出现，超出5SD说明有明显偏差，数据不可靠。,反映稳定性的评价指标可有Cusum图、质控图等。质控图（Shewart作用法）或Levey Jennings：可选多种参数如B0、NSB%、EOX、QC0假如选QC，求出它的SD（需多批可靠实验求出平均SD值）。然后作图：以后的实验中测得的QC SD可用该图评价。正常要求：大于2SD不得超过5%大于3SD不得超过1%,如果有下列情况之一发生，说明实验失败、应舍弃该批数据：1）三个QC样品有一个SD大于3SD2）三个QC样品有二个SD大于2SD3）三个QC样品都同侧超出1SD,
