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1、根癌农杆菌介导的植物基因遗传转化技术,常用的植物基因转化技术,农杆菌介导法植物病毒载体介导法（如CaMV）DNA直接导入法（PEG介导法、脂质体法、基因枪法、电激法、激光微束法、显微注射法等）种质系统介导基因转化（花粉管通道法等）其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐,若干主要的植物细胞转化方法的比较,若干主要的植物细胞转化方法的比较,与植物基因转化有关的农杆菌,根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：含有Ti(Tumor-inducing plasmid)质粒，能诱导被侵染的植物细胞
2、形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤。发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）：含有Ri(root-inducing plasmid)质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA(transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒已成为植物基因转化中的理想载体系统。,根癌农杆菌(Agrobacterium tum
3、efaciens),在植物基因工程的发展中,研究最清楚和应用最成功的是根癌农杆菌介导的遗传转化,在已获得的近200种转基因植物中约80%是由该菌介导完成的.起初,人们认为农杆菌仅能转化双子叶植物、裸子植物以及少数几种单子叶植物;而近几年,由于在一些重要的单子叶植物以及在真菌中应用农杆菌转化获得了成功,该方法以转基因低拷贝、遗传稳定以及能够转化大片段DNA等优点又受到了人们极大的关注.,Ti质粒,Ti质粒（tumor-inducing plasmid）：Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti质粒中有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA），能
4、转移并整合到植物基因组中，并导致冠瘿瘤的形成,Ti 质粒可分为4 个功能区域：T-DNA区：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，含有编码植物激素和冠瘿碱的基因；Vir 区：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性；Con 区(接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移；Ori区(复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。,Ti质粒介导转化的过程,农杆菌吸附于植物的表面伤口部位受酚类物质（乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香酮）的诱导，vir区基因被激活，virD基因编码的
5、核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝（T-链）T-链在RB序列的引导下定向穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中T-DNA在植物细胞中表达,整个过程大致可分为以下几个步骤,根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着；根癌农杆菌对植物信号物质的感受；根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色体上操纵子的活化；T-DNA 复合体的产生；T-DNA复合体的转运；T-DNA整合到植物基因组中。,植物表达载体构建Onc卸甲载体（受体Ti质粒）的构建,野生型Ti质粒不能直接用作克隆外源基因的载体：1.质量过大 2.酶切位点多 3
6、.T-DNA区Onc基因干扰宿主激素平衡 4.不能在大肠杆菌中复制 5冗余基因Onc卸甲载体：无毒的Ti质粒载体。切除了T-DNA中的Onc致癌基因。缺失部分被大肠杆菌的常用质粒pBR322区段（含Ampr)取代。任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。,改造后的Ti质粒的基本结构,DNA复制起始位点选择标记基因T-DNA的边界序列多克隆位点,左边界序列,右边界序列,植物表达载体构建中间载体的构建,带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为“中间载体”。基本原理是把T区（即Ti质粒能整合到植物基因组中去
7、的一段DNA，总长度约为23kb）片段克隆到普通载体pBR322上，把外源基因插入到该T区后再导回受体细胞中，使外源DNA转移到Ti质粒上，再经根癌土壤杆菌转化植物把该外源片段导入植物体内。,植物表达载体构建共整合载体系统(cointegrate vector system),由卸甲Ti质粒载体、中间表达载体组成。例如：pGV3850、pLGVneo1103外源基因首先克隆到一个中间载体（带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒）上，该载体含有一段与缺失T-DNA的Ti质粒有同源序列。当该载体进入土壤农杆菌后，与Ti质粒整合，然后由Ti质粒提供T-DNA向植物细胞转移的vir基因产物。,Ampr,植物
8、表达载体构建双元载体系统(binary vector system),由微型质粒、辅助 Ti质粒组成。例如：Bin19、pAL4404 包括两个彼此相容的穿梭载体（微型质粒）和辅助Ti质粒。穿梭载体不带有vir基因，但带有大肠杆菌及土壤农杆菌的复制起始位点。所有基因操作可以在大肠杆菌中完成，之后转入一种经修饰后的Ti质粒农杆菌中，该Ti质粒包含一整套vir,但缺失T-DNA序列而无法转移，这样可提供仅vir基因产物帮助双元载体转移。,双元载体杆菌与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制，从大肠杆菌转移到农的频率比共整合质粒的转移频率高100
9、00倍。且改造的Ti质粒时其多克隆位点无导入pBR322质粒的同源片段。,三亲交配法（triparental mating）,无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把中间载体质粒由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都需要三种细菌参与，通常把这一过程称为三亲交配法 1.受体农杆菌 2.协助菌（带有协助质粒的大肠杆菌）3.供体菌（带有重组植物表达载体的大肠杆菌）原理：三种菌混合时，协助质粒游动进入供体菌中，将供体菌中的表达载体转移到受体菌中，最后经过适当的抗生素筛选即可获得土壤农杆菌转化结合体,Ti 质粒介导的转移转化方法,基本程序包括：含重组Ti质粒的根癌农杆菌的培养，选择合适的外植体，根癌农杆菌与外植
10、体共培养，外植体脱毒及筛选培养，转化植株再生等步骤。叶盘转化法原生质体(或愈伤组织)共培养转化法整株感染法直接转化法（电击法，液氮冷冻法）,叶盘转化法,打孔器从消毒叶片上打孔，获得 圆形叶片，即叶盘将叶盘放入根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌浸染叶盘滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将处理过的叶盘置于培养基上共培养23d，再转移到含有头孢霉素或羧苄青霉素的培养基中，除去根癌农杆菌。与此同时在该培养基中加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞再生为植株。对这些再生植物进行分子检测就可确定它们是否整合有目的基因及其表达情况。叶盘转化法已在多种双子叶植物上得到成功的应用。实际上，其他的多种外植体，例如茎段、
11、叶柄、胚轴、子叶愈伤组织、萌发的种子均可采用类似的方法进行转化。该方法的优点是适用性广且操作简单，是目前应用最多的方法之一。,叶盘转化法,原生质体共培养转化法,以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。与叶盘转化法相比，此法得到的转化体不含嵌合体，一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化体。应用此法进行基因转化时，其先决条件就是要建立起良好的原生质培养和再生植物技术体系。,整株感染法,人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质粒的根癌农杆菌
12、注射到植物体内，使菌体在植物体内进行浸染实现转化。为获得较高的转化频率，多采用无菌种子的实生苗或试管苗。,在筛选转化体时，可将感染部位的薄壁组织切下放入选择培养基上及诱发愈伤组织的培养基上进行筛选和愈伤组织诱导。最后将转化的愈伤组织转移至含合适植物激素的培养基上诱导再生植株在拟南芥(Arabidopsis thaliana)上，将根癌农杆菌涂于植株腋芽处或顶牙，可长出转化的新枝条，新的转化枝条开花结实后，也可以获得转基因种子；或者通过真空渗透或农杆菌浸泡拟南芥开花植株，等结实之后，利用筛选萌芽种子的方法，也可以得到转基因植株及种子。,根癌农杆菌介导转化植株的基本程序,植物表达载体构建（E.co
13、li）选择受体材料重组质粒转化农杆菌（三亲）建立植株再生体系 遗传转化到宿主细胞（共培养）转化体筛选（抗生素）植株再生（组织培养）转基因植株的检测（PCR、分子杂交等）田间试验、遗传分析、性状鉴定,转基因植株的检测,1 报告基因的检测：报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记,因而易于进行转化后的筛选。利用酶法分析、通过同位素放射性自显影技术及底物的颜色反应可以快速鉴定报告基因的表达,从而有效地检测出重组细胞或组织。根据报告基因编码特点,大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因。2 PCR 检测转化植株：PCR 是在体外快速特异地扩增目的基因DNA 片段的有效方法
14、。能在几小时内使pg 水平的起始物达到ng 乃至g 水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。这项技术可用于转化后外源基因的鉴定和植物基因组的分析3 DNA水平：点杂交和Southern 杂交，转录水平：Northern 杂交，蛋白质水平：Western杂交。这些技术需要转膜、杂交,操作繁琐,费用高,不适合大批量样品的检测,可对转基因植株随机取样检测,转基因植物的应用一、转基因植物在植物分子生物学研究中的应用1、转座子标签法 玉米的Ac/Ds、En/Spm和金鱼草的Tam转座子系统,2、T-DNA标签法 3、反义RNA技术4、位点特
15、异性重组技术二、改良植物品种1、抗虫转基因植物2、抗病转基因植物3、抗除草剂转基因植物4、抗逆境转基因植物 5、改良营养品质转基因植物6、转基因“工程三系”7、改变花形花色的转基因植物,三、转基因植物作为生物反应器 优点：安全、廉价、高效、规模化1、转基因植物生产疫苗 1990年Curtiss等人利用转基因烟草表达链球菌表面蛋白抗原A，用该转基因烟草饲喂小鼠，能引起免疫反应。植物表达系统生产疫苗的特点：成本低廉；免疫活性高；安全性好；易于贮存和运输；使用方便。包括：稳定表达系统、暂态表达系统,2、转基因植物生产抗体 1989年Haiti获得分别表达抗体重链和轻链的转基因烟草植株，杂交后在杂种中获得了与抗原结合的抗体。迄今，不同类型的完整抗体如IgG1、IgM、IgA、Fab抗体、IgG1/IgA嵌合抗体、单链抗体(scFv)和单域抗体(VH)等基因都先后转入烟草、拟南芥、伞藻和大豆等作物中，并得到表达。3、转基因植物生产其他多肽类药物 1988年比利时PGS公司首次利用转基因烟草生产神经肽。,
