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1、植物学及植物生理学教研室王连翠,A Glimpse of Plant Tissue Culture,第一章 绪论第二章 基本技术与设施第三章 培养基第四章 愈伤组织第五章 器官培养 第六章 植物脱毒技术第七章 细胞培养与原生质体培养,植物组织培养,本课程学习目标,掌握基本原理 掌握基本概念 了解开展组织培养工作的基本设施 掌握植物组织培养基本的操作技术 掌握植物组织培养在植物快繁脱毒等方面的应用,概念,类型,形成与发展,应用,原理,第一章 植物组织培养的基础知识,植物组织培养（Plant tissue culture）：指在无菌和在人工控制下，将离体植物的器官、组织、细胞以及原生质体培养在人工
2、配制的无菌培养基上，在适宜的培养条件（营养、光照、温度）下，使其继续分裂、分化和发育的技术。植物离体培养（Plant in vitro culture）试管培养（In test-tube culture）,一、植物组织培养的概念,二、组织培养的原理,1细胞全能性学说植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。全能性只是一种可能性。要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件：一：离体的条件下。二：要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。全能性体现的两个过程脱分化过程再分化过程。再分化的过程有两种方式：器官发生方式 胚胎发生方式
3、,2.激素（植物生长调节剂）调控,（1）生长素用于诱导愈伤组织的形成，体细胞胚的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽和不定芽的产生。常用的生长素:2,4二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚丁酸（IBA）等。作用强弱顺序:2，4-DNAAIBAIAA。,(2)细胞分裂素促进细胞分裂与分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成，促进侧芽生长及显著改变其他激素作用的特点。常见的细胞分裂素有：2异戊烯腺嘌呤（2-iP）、玉米素（ZT）、6苄基氨基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、苯基噻二唑基脲（TDZ）。作用强弱顺序:TDZ 2ipZT6BAKT
4、。(3)赤霉素在植物组织培养中应用的仅有GA3一种，它是一种天然产物，能促进已分化芽的伸长生长。其他植物生长调节剂:如脱落酸（ABA）、乙烯利（CEDP）等在植物组织培养中也有一定的应用。,注：生长素/细胞分裂素的比值:大时有利于根的形成，这时生长素起主导作用；比值小时，则促进芽的形成，这时细胞分裂素起主导作用。,图式,三、组织培养的类型,将外植体接种在培养基上，由于植物生长调节剂的存在，其细胞脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。愈伤组织是一种最常见的培养形式，因为除茎尖分生组织和一部分器官以外，其他的几种培养形式最终也都要经过愈伤组织才能再生植株。愈伤组织的形态发生途径:胚胎发生
5、途径 器官发生途径,(1)愈伤组织培养,器官培养是通过培养器官的类别来分类的。培养的是什么器官，就称为什么培养。如根、茎、叶、花、果实、种子的培养。,(2)器官培养,胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。胚培养用途：1.拯救胚。2.研究胚的发育营养研究。3.一些特殊的领域的研究。,(3)胚培养,英国批准在实验室培养人和动物混合胚胎用于研究,细胞培养：将植物的单个细胞或细胞团分离出来，放在培养基上进行培养。原生质体培养：指将植物细胞的细
6、胞壁通过物理或化学的方法去除，然后再进行培养。原生质体培养的最大用处是体细胞杂交。,Atropa belladonna（颠茄）,(4)细胞和原生质体培养,70年代以后有关植物原生质体培养和体细胞杂交的研究得到了很诀发展，如烟草、曼陀罗、颠茄、胡萝卜、油菜等能从其原生质体经培养再生分化长成胚或完整的植物，利用原生质体融合已经能使烟草属和矮牵牛属的杂种细胞增殖分化成杂种植株。,Atropa belladonna（颠茄）,四、组织培养的发展简史,组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段：萌芽阶段（从20世纪初至20世纪30年代中）奠基阶段（从20世纪30年代末到20世纪50年代中）快速发展阶段和应用阶
7、段（从20世纪50年代到现代）,在Schleiden和 Schwann所提出的细胞学说的推动下，德国植物生理学家Haberlandt于1902年提出了高等植物的器官和组织可以不断分割,直至分到单个细胞观点和细胞全能性观点。1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。后来，Laibach（1925，1929）把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子胚剥出，在培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些成功，这是有关根培养的最早的实验。,萌芽阶段（从
8、20世纪初至20世纪30年代中）,Schleiden,Matthias Jakob(1804-1881),Theodor Schwann,Theodor(1810-1882),细胞学说,奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）,30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素-一种天然的生长调节物质。1934年，White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功。起初，他在实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。后来（1937），他用3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，取代酵母
9、浸出液获得成功。此合成培养基后被称为White培养基。Gautheret（1934）在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织也可以不断增殖几个月，但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，山毛柳形成层组织的生长才能显著增加。这些实验揭示了B族维生素和生长素的重要意义，又直接导致了1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成获得首次成功。同年，white由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜也建立了类似的连续生长的组织培养物。Gautheret，White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。40年代和50
10、年代初期，活跃在植物组织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的主要内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成Skoog（1944）和崔徵等（1951）发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例控制芽和根形成的主要条件之一。这些实验结果导致了激动素和以后利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化工作开展。,50年代开始以后的10年中，引人注目的植物组织培养的研究进展有以下6项：1952年，Morel和 Martin首次证实，通过茎尖分生组织离体培养，可以由已受病毒侵
11、染的大丽花中获得无毒植株。19531954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。并对分离的单细胞进行了“看护培养”。实现Haberlandt培养单细胞可能性的这一设想。1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出细胞分裂素，并把它定名为激动素（kinetin）。具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合物已有多种，它们总称为细胞分裂素（cytokinin）。应用这类物质，我们就有可能诱导已经成熟和高度分化的组织（如叶肉和干种子胚乳）细胞进行分裂。1957年，Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念。指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通
12、过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化。二者浓度相等时，组织则趋向于以一种无结构的方式生长。后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的
13、茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。19581959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物任何部分都可以得到体细胞胚，如胡萝卜和毛茛上。,（l）原生质体培养取得重大突破 1960年Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971
14、年，Takebe等在烟草上首次。由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。1972年，Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种，后来在有性亲合及有性不亲会的亲本之间，不同作者又获得了若干其他的体细胞杂种。（2）花药培养取得显著成绩 1964年，Guha和Maheshwari报道，在南洋金花中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作
15、用，这一领域的研究在整个70年代得到了迅速发展，获得成功的物种数目增加到180余种，其中包括很多种重要的栽培植物。烟草、水稻和小麦等的花培育种在中国取得了引人注目的成就。（3）微繁技术得到广泛应用 1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法。繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”。目前，用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。除兰花外，在其他很多观赏植物和经济作物（如甘蔗和草莓等）中，快繁也已达到了工厂化消生产规模，在若干作物中与通过整尖培养进行脱毒相结合，产生了可观的经济效益。,快速发展阶段（从20世纪60年代至现在）,挽救濒临灭绝的植物快速繁殖某些稀有植物或有较大经济价值的植物利用植物组织培养的材料作为植物生物反应器植物组织培养结合超低温保存技术经济有效地保存植物种质资源用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、生物工程等的研究,五、组织培养的应用,1什么是细胞全能性学说？如何理解?2什么是植物组织培养?3植物组织培养常用的激素哪些类型？各类激素又有哪些常用种类？4植物组织培养的主要类型有哪些？,复习题,1、植物无糖组培的概念及意义,植物无糖组培快繁工厂化生产技术CO2,
