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1、第十章植物细胞培养的基本过程和方法,第一节 植物细胞的获取,细胞来源：1、外植体；2、愈伤组织,1、外植体的选择：适当生长期的健康植株、细胞之间粘连程度小；叶片组织2、外植体的前处理：（1）冲刷材料;流水 几分钟-数小时 吐温(2)表面浸润灭菌；超净台 70%酒精 10-30S（3）深层灭菌；氯化汞 次氯酸钠（4）无菌水冲洗。3min/次 3-10次,一、从外植体直接分离植物细胞,二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞,愈伤组织的概念-P173形成过程：1、起始期；（诱导期）准备进行分裂2、分裂期；细胞体积变小分生状态3、形成期。大小稳定 内部深层细胞开始分裂,怎样从愈伤组织分离得到细胞？,P175
2、 获得愈伤组织后，挑选质量好的愈伤组织块，用无菌的镊子或小刀分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养基中，加入经过灭菌处理的玻璃珠，进行振荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。果胶酶 增强分散效果,第二节 悬浮培养（cell suspension culture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。,1、悬浮细胞的诱导-愈伤组织诱导 要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。适于悬浮培养
3、 适于再生植株,如何获得符合要求的愈伤组织？1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶 是最常用的外植体，特别是幼胚。2、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要 配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性 好、细胞状态好的细胞不断继代培养。,悬浮细胞生长动态：,基本的悬浮培养体系均是将细胞分散在一定容积的培养液中进行，在一个培养周期不添加培养基。这种培养体系基本是处于封闭状态。当一种营养物质耗尽时，细胞即停止生长。在这种悬浮培养体系中，细胞扩增生长成S形曲线。,细胞生长指标,1、细胞生长计量:细胞计数 细胞密实体积 细胞鲜重 细胞干重2、细胞活力测定,悬浮细胞培养的同步
4、化,细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。,体积选择法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。,饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。,抑制法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期G1期的同步化细胞。,低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞 同步化程度。,第三节 固定化培养,
5、细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。方法：吸附法、包埋法,包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；吸附式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。,第四节 单细胞培养,悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能进行定点选择。因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。,1、平板培养 2、看护培养3、微室培养4、条件培养（双层滤纸培养）,1、细胞平板培养 平板培养(plate
6、culture)：将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。单细胞的分离：用于平板培养的小细胞团不能超过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速离心，培养液洗涤2次后，调整密度为5105ml。植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度约12mm。封口：用石蜡膜封培养皿。,2、看护培养看护培养（nurse culture）：是由Muir1954年设计的。操作方法：在固体培养基上置入一块活跃生长的愈组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微
7、小细胞团以后，将其直接转至琼脂培养基上让其 迅速生长,3、微室培养,它可对单细胞进行活体连续观察。这一方法也可用于原生质体培养观察细胞壁的再生和细胞分裂过程。,4、双层滤纸培养 Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法。,第五节 原生质体培养,原生质体的特点:具有全能性；无细胞壁障碍；吸收能力强、分泌能力提高；可进行细胞融合。,原生质体的制备,基础材料准备预处理与酶解（或机械破壁）原生质体收集与纯化原生质体活力测定,1、用于分离原生质体材料的准备,无菌试管苗叶片,培养细胞,2、预处理与酶解,材料预处理：子叶、下胚轴;叶片;愈伤组织或胚性悬浮细胞,叶
8、肉原生质体,酶处理：酶浓度 酶解时间 酶解温度,3、原生质体的收集和纯化,飘浮法：常用的飘浮剂：蔗糖。沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。,4、原生质体活力检测,目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。,原生质体培养方法,
