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1、细胞融合Cell Fusion,细胞工程电子课件,华中农业大学生命科学技术学院,细胞融合的概念与意义,融合细胞的制备,细胞融合的方法,融合细胞的选择与鉴定,主要内容,番茄薯,多利,白菜甘蓝,5.1 细胞融合的概念与意义,细胞融合（cell fusion）,即细胞杂交（cell hybridization），在外力（诱导或促融剂）作用下，两个或两个以上的细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。,对称融合（symmetricfusion）,非对称融合（asymmetricfusion）,用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类：物理方法常采用射线处理，
2、如X射线、r射线等，它们能使细胞核失活；化学处理目前常用的试剂有：核失活碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(IA)；质失活罗丹明（R-6-G）。R-6-G是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。,对称杂种：亲本双方原生质体完全融合在一起，相互之间未发生排斥，杂种的体细胞染色体数目为双亲之和，其外部形态呈中间类型。结果在导入有用基因的同时，也带入了亲本的全部不利基因（或性状），一个杂种中有两套不尽相关的基因并不是试验所期望的，这样常导致部分或完全不育，因而难以形成育种上的有用材料。,不对称杂种：亲本双方原生质体发生部分融合，或发生了融合，但融合体在分裂过程中一方的部分核或质被排斥，
3、因而其体细胞染色体数目达不到双亲之和。其外部形态呈双亲的中间型或偏一方形态，一般表现为雄性器官退化，正常花粉粒极少，育性低。胞质杂种：携带一个亲本的核和两个亲本的细胞质。,细胞融合的意义,实现远缘遗传重组 创造新的遗传型 转移抗逆性状，改良作物品质 通过原生质体融合转移细胞质基因控制的性状,植物,next,第一个体细胞杂种(Carlson，1972),第一个属间体细胞杂种Pomato（Melchers，1978）,禾本科 eg.籼稻与野生稻,木本植物 eg.柑橘,据不完全统计，通过体细胞杂交至少已获得44个种内，103个同属异种，48个属间，5个科间的细胞杂种，其中非对称融合的体细胞杂种在90
4、%以上。（李杰等，2003）,1980年，Butenko、Kuchko获得抗Y病毒的马铃薯杂种植株。,中国农业科学院烟草研究所得到品质优良、兼抗多种病害的烟草新品系。,用于单克隆抗体、核酸疫苗制备，为大规模生产特定生物制品培育种子细胞。动物个体克隆，培育动物新品种，使牲畜迅速实现良种化。在基础理论研究上 动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制与诊治等方面都有重要意义。,细胞融合的意义,动物,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984for the discovery of the principle for production
5、 of monoclonal antibodies,Georges J.F.Koehler Federal Republic of Germany Basel Institute for Immunology Basel,Switzerland b.1946 d.1995,Car Milstein Argentina and United Kingdom MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge,United Kingdom b.1927(in Bahia Blanca,Argentina)d.2002,5.2 融合细胞的制备,5.2.1 植物
6、原生质体的制备,原生质体(protoplast)除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。,Isolated protoplasts have been described as naked cells because the cell wall has been removed by either a mechanical or an enzymatic process.In the isolated protoplast the outer plasma membrane is fully exposed.,1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。
7、,亚原生质体(subprotoplast)核质体(nuclearplast)胞质体（cytoplast）,原生质体的分离,基础材料准备,预处理与酶解,原生质体活力测定,原生质体收集与纯化,用于分离原生质体的材料准备,无菌试管苗叶片子叶和下胚轴愈伤组织和培养细胞,预处理及酶解,酶的种类,纤维素酶（Cellulase）半纤维素酶（Hemicellulase）果胶酶（Pectinase）,溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。,酶溶剂及其渗透压,酶处理,原生质体游离,沉淀法,原生质体的收集和纯化,飘浮法,界面法,以柑桔为例,果胶酶纤维素酶,原生质体活力测定,目测法在
8、显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。,FDA（二乙酸荧光素）法 机理？,有活力的Protoplast发荧光,无活力的Protoplast被染色,伊凡蓝法 机理？,影响原生质体活力的因素,分离材料的生理状态,酶解条件,酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压,分离条件,离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间,环境条件,操作环境的温度、分离用具的影响,5.2.2 动物单细胞的制备,用胰蛋白酶、机械法或二者兼用来分离细胞，对其进行单层或悬浮培养，获得单个分散的细胞。,5.3 细胞融合的方法,5.3.1 生物融合法-仙台病毒法,病毒类是研究得最早的促融剂疱疹病毒、天花病毒、
9、副流感型病毒、副黏液病毒等致癌、致病病毒，都能诱导细胞融合毒性大，应用受到限制,德国生理学家 Johannes Mller 1801-1858,1958年，日本学者冈田善雄（Okada）发现了HVJ病毒可促进细胞融合。仙台病毒（HVJ）毒力低，对人的危害小易被紫外线或丙炔内酯所灭活,日本学者Okada,诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的 RNA，而是它的外膜。,不同细胞融合速度不同，快的370C中5min即可。,细胞的融合与病毒的数量、温度有关。,每一细胞必须有足够数量的病毒颗粒附在细胞膜上，细胞才能凝集。,融合要在较高的温度中进行，一般是370C。,融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率
10、较高；融合过程不受物种限制。,5.3.2 化学融合法-PEG法,PEG诱导融合的特点,桥梁,PEG的作用机理,融合液：CaCl2 2H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.51.0mol pH 5.6,诱导液：融合液PEG 2045,稀释液：A液（g/100ml）pH6.0 B液（g/100ml）pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169,洋葱根尖原生质体（40）,烟草叶肉原生质体（40）,烟草叶肉细胞和洋葱根尖细胞原生质体融合,烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合,PEG融合的影响因素,原生质
11、体的群体密度,PEG的相对分子量与含量,Ca2+浓度和pH值,融合液的渗透压和温度,培养时间,其他,-的原生质体悬浮液形成的异核体频率最高。,PEG6000效果较好；含量以-较为适宜。,Ca2+可提高PEG诱导频率；同时与pH值相关。,甘露醇浓度为0.4mol/L0.7mol/L范围内。保温温度一般在C左右。,NO3-/NH4+;与DMSO并用,异核发生率第四天达高峰，之后下降。,电融合法（electrofusion technique）是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，以电降解及双向电泳的联合作用为基础。,5.3.3 物理融合法-电融合法,电融合过程的分子机制,烟草原生质体（40）,
12、原生质体成串（40）,原生质体融合,电融合仪的结构特点交变电场部分 高频直流电击部分,电融合的影响因素,基因型,原生质体的密度,Ca2+浓度,交变电场强度,直流高电压脉冲,电融合法的优点：,融合技术操作简便。,不存在对细胞的毒害问题；,融合效率高；,其他方法,激光诱导细胞融合法空间细胞融合技术离子束细胞融合技术,5.4 融合细胞的选择与鉴定,细胞融合的方式,细胞融合的产物,自体融合,异体融合,同核体（homokaryon）,异核体（heterokaryon）,5.4.1 动物融合细胞的选择培养技术,次黄嘌呤鸟嘌呤核糖磷酸转移酶缺失型细胞株,（含有次黄嘌呤H，氨基喋呤A和胸腺嘧啶T）,次黄嘌呤胸
13、腺嘧啶核糖磷酸转移酶缺失型细胞株,（含有次黄嘌呤H，氨基喋呤A和5-甲基脱氧胞苷M）,HGPRT-,dcD-,HAM培养基,5.4.2 植物体细胞杂种选择与鉴定,杂种细胞选择系统,形态特征选择,互补选择,荧光标记选择,生长特性选择,next,形态特征选择（morphology trait selection)根据细胞或原生质体的大小、颜色、漂浮密度、电泳迁移速率、细胞繁殖状态上的差异等进行选择。,大豆下胚轴原生质体,烟草叶肉原生质体,一半含有叶绿素，另一半含淀粉粒,生长特性选择（growth trait selection),eg1.,粉蓝烟草,郎氏烟草,无生长素,Carlson，1972,e
14、g2.,互补选择（complenetary selection）抗性互补（resistande complenetary selection)营养缺陷型互补（auxotroph complemetary selection）遗传互补（genetic complemetary selection）,Nicotiana sylvestris,Nicotiana knightiana,抗卡那霉素、失去再生植株能力,有生长Callus能力、但从未形成植株,卡那霉素,eg1.,eg2.两个不同类型的硝酸还原酶缺失突变体烟草融合，二亲本均不能在在硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长，而杂种细胞则可以生长（Glimelius，1978）。,荧光标记选择：亲本标记不同荧光,eg.异硫氰酸荧光素（FITC）和异硫氰酸罗丹明（RITC）分别发出绿色和红色,2体细胞杂种的鉴定,形态鉴定,细胞学鉴定,生化鉴定,分子鉴定,根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。,细胞器鉴定、染色体鉴定。,同功酶鉴定。,RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。,18条染色体,36条染色体,RAPD带型,RAPD带型,思考题,原生质体定义原生质体分离、纯化方法原生质体融合方法及原理原生质体融合的意义体细胞杂种鉴定方法体细胞杂种应用实例,
