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1、细胞克隆与种子细胞筛选,第三章,细胞工程电子课件,华中农业大学生命科学技术学院,细胞克隆的概念与意义,植物单细胞培养技术,动物细胞克隆技术,种子细胞筛选,主要内容,3.1 细胞克隆的概念与意义,细胞系,细胞克隆,细胞株,直接从机体取材的细胞、组织或器官所做的原代培养，进行传代培养后形成的一群生物学特征不均一的细胞便称为细胞系(cell line)。,有限细胞系（Finite Cell Line）无限细胞系（Infinite Cell Line）,一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来。分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法成为细胞的克隆化（cloning）。,从原代培养物或细胞系中分离
2、单个细胞进行培养，形成均一的细胞群，这群细胞具有一定的生物学特性和遗传标记，并在继代培养中仍能保持其特性和标记，这群细胞就称为细胞株(cell strain)。,3.2植物单细胞培养技术,愈伤组织诱导,平板培养,看护培养,微室培养,其他改进培养技术,3.2.1 愈伤组织诱导,诱导获得的愈伤组织可以用镊子或小刀分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到培养基中，加入经过杀菌处理的玻璃珠，进行振荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。,3.2.2 平板培养,所谓平板培养（plating culture）
3、是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体体培养基中进行培养的技术。,单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5105/ml。植板：将1份已调整好密度的但细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为5mm左右。,平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。,3.2.3 看护培养,看护培养（nurse culture）技术首先是有Muir等（1954）设计的，其操作方法是在固体培养基上置入一块活跃生长的愈伤
4、组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长。,3.2.4 微室培养,微室培养（micro-chamber culture）是为进行单细胞活体连续观察而建立的单细胞培养技术，运用这种技术可对单细胞的生长与分化、细胞分裂的全过程、胞质环流的规律等进行活体连续观察。这一方法同样也可用于原生质体培养，用于观察细胞壁的再生与细胞分裂过程。微室培养是细胞学研究的优良实验体系。微室培养首先是由Jones等在1960年设计的。,3.2.5 其他改进培养技术,Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立
5、了双层滤纸植板培养方法，该方法是在培养皿中倒入琼脂培养基凝固后，先将饲养细胞平铺在培养基上，然后在饲养细胞层上平展一张滤纸形成看护层，再将滤纸制成的圆碟置于看护层上，然后将培养细胞植于其中。,3.3 动物细胞克隆技术,原代培养,继代培养,单细胞克隆,3.3.1 原代培养primary culture,取材,培养,组织解离机械分离,取材,解离一般是借助酶和鳌合剂处理组织，使其成为分散的细胞。常用的酶有胰蛋白酶和胶原酶，鳌合剂主要有EDTA-Na和柠檬酸钠。,一般直接用镊子、解剖刀解剖组织、器官，然后加以整理用于培养。,动物细胞原代培养过程,不同取材方法，原代细胞培养方式亦不相同.一般来讲，分离获
6、得的材料多采用组织块培养，而通过解离获得的细胞材料多采用单层细胞培养和悬浮培养。,培养方法,组织块培养 将组织剪切成碎块 用平衡盐溶液漂洗 在解剖镜下切除脂肪、坏死组织等 切成1mm3大小 再漂洗2-3次 转移到培养瓶内培养。,特点 直接切割分离的组织块，在一定程度上保持了原有的组织结构，对于初期体外培养的环境适应性比直接分离成单细胞要强，因此，短期组织块培养成为动物细胞培养的材料来源之一。,将解离获得的细胞沉淀用培养液配制成需要的细胞悬液接种到培养瓶内水平放置，37下静止培养每隔1-2天换培养液一次培养一定时间后，细胞在培养瓶底即形成一单细胞层。,单层细胞培养,特点 更换培养基容易便于观察不
7、同条件对细胞生长的影响培养后期容易使用灌注技术改善营养条件细胞贴附于基底质上，更容易表达产物单层细胞培养可适用于许多动物细胞的原代培养。,适用细胞 具有非贴壁特性的细胞，如血细胞、腹水细胞等，或者通过机械搅拌和振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。,悬浮细胞培养,在相应的培养容器内接种一定密度的细胞悬液。接种密度与细胞倍增时间有关，倍增时间在24-48h的细胞类型接种密度以105/ml细胞为宜，倍增时间在12-18h的细胞类型接种密度以2104/ml为宜。单个培养瓶的接种体积以厚度不超过2cm为好。,基本方法与植物细胞的悬浮培养相似,3.3.2 继代培养subculture,单层细胞培养 贴壁细胞
8、再培养悬浮培养 非贴壁细胞培养,从原代培养物中解离细胞：震荡法 在培养瓶中加入平衡盐溶液，轻轻震动培养瓶，可以使贴壁疏松的细胞进入到溶液内，然后收集洗涤用于培养。蛋白酶消化 用PBS配制0.01-0.5%的胰蛋白酶消化液，37处理5-15min.，然后洗涤用于培养。,EDTA溶液洗涤 用PBS配制1mmoll-1d EDTA，弃去原代培养的培养液，转入EDTA洗涤细胞，然后再用0.25%的胰蛋白酶消化，次法用于贴壁性极强的细胞获取。机械剥离 用细胞刮、细胞铲或其它工具直接剥离原代培养物。,切取拟培养的动物器官或大组织块 洗去血污 剔除多余成分切成约1mm3大小的组织块 将所有组织剪碎用于组织培
9、养 蛋白酶溶液消化 机械方法吹打组织块 离心、培养液悬浮 计数、调节细胞密度 用于分离细胞培养,动物细胞的培养步骤,例1 乳鼠肾细胞原代培养 准备工作A 培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。B 点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等。,乳鼠肾细胞原代培养,a.采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死b.将小鼠放入盛有酒精的烧杯中数秒c.置超净工作台内 d.打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔e.用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱,f.取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中 g.用吸管吸取PBS加入培养皿中,清洗肾脏3次
10、,尽量去掉血污.h.将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBS漂洗，去净血液.,1.将洗净的组织块移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的组织块。2.加入5-8倍体积的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37水浴中消化20-30分钟,注意应每隔5分钟振摇一次。3.当组织块变得疏松,颜色略白时，取出置于超净工作台内.,胰蛋白酶消化,4.用吸管反复吹打组织块,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态。5.加入1-2ml培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉,将上部的组织悬液移入无菌离心管中。,1.800-1000rpm离心8-10min,取上清加入适量培养液,细胞计数后分装；2.在细胞瓶(板
11、)上标明细胞名称，代数，日期；3.倒置显微镜下观察细胞分散情况后置37孵箱中培养。,离心及计数,培养细胞每天观察，检查：A.污染与否?B.细胞生长状态。,细胞观察,如见培养液变为黄色且又混浊，为污染;如培养液为桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时，24h内有细胞贴壁，圆形悬浮状的细胞延展成短梭状。,培养3-4天，细胞生长繁殖，可见细胞岛形成。细胞透明，颗粒少，界线清。由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时应换液。,例二 鱼类细胞培养 鱼类原代细胞的培养 A 断尾（或剪腮）放血 B 用0.01高锰酸钾溶液或70的乙醇浸泡消毒30分钟。C 70酒精棉球擦
12、洗解剖部位 D 剖开腹腔，取出组织，清除粘膜和血液，剪碎，维持液(Hanks液)或缓冲液(PBS)洗。,E 用0.25胰酶消化(20，30或4，过夜)F 离心(1000rpm,10),弃去消化液G 用培养基重悬，计数，分装培养(应在2x104个细胞/ml 以上)。,A 长成单层的细胞弃去培养基，加胰酶EDTA，消化后弃去消化液B 加培养基，吹打分散C 分装培养,传代细胞的培养,培养的鱼类传代细胞及显微观察,结晶紫染色,荧光染料染色,活体细胞,3.3.3 单细胞克隆,细胞克隆化的技术大致可归纳为三类。稀释铺板 用足够体积的培养液稀释细胞悬液，使铺板后呈单个细胞分布。基质附着 将稀释的细胞悬液接种
13、到适当的基质上，使单个细胞在基质上固着、繁殖生长，形成细胞群落，然后再取单个细胞群落进行再培养。琼脂克隆 有些细胞如病毒转化细胞，可以悬浮状态克隆化，因此可以采用植物细胞克隆的方式，用琼脂或琼脂糖包埋。,3.4种子细胞筛选,种子细胞的概念及意义,选择压筛选,细胞诱变,3.4.1 种子细胞的概念及意义,适用于工业化生产的种子细胞，必须满足以下几个基本条件：分散性好；均一性好；生长迅速；细胞中次生产物含量高；细胞生长和次生产物合成能力稳定。,植物细胞经过多次培养以后，往往会发生变异，需要从中选育出优良的植物细胞，使其特性得以保持或改良。,植物细胞选良和改良方法,筛选诱变,3.4.2 选择压筛选,正
14、选择就是把受选择的细胞群体置于一定的选择压力下，部分细胞在选择压力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗选择压力的细胞可以生长，从而选择得到所需的细胞。,正选择适用于对抗性突变体的选择。如以NaCl为选择剂选择耐盐突变体，以除草剂为选择剂选择抗除草剂突变体等。,正选择可一步完成，也可分多步完成。一步选择法有利于筛选单基因突变的细胞，而对于遗传背景不详且可能是多基因的突变或是细胞质基因突变，采用多步法为好。,负选择法也叫富集选择法。在植物细胞筛选中，常用致死富集法。在负选择实验中，选择的对象是在一定选择压的作用下不能生长的那些细胞，而能够生长的细胞受到淘汰。,负选择适用于对营养缺陷型突变体的选择。,影
15、响细胞筛选效果的因素,亲本材料对筛选效果的影响培养方式对细胞筛选效果的影响细胞生长速度对细胞筛选效果的影响选择压力的施加方式对细胞筛选效果的影响,亲本材料对筛选效果的影响,亲本材料的选用是否得当，对于细胞筛选的成败有重要影响，首先应该选用优良的、仅存在个别缺点需要改进的基因型。还必须注意染色体的倍数性水平和培养细胞再生植株的能力。,培养方式对细胞筛选效果的影响,用来进行筛选的细胞，基培养方式主要可分为四种：愈伤组织培养、细胞悬浮培养、细胞固体培养和原生质体培养。,细胞生长速度对细胞筛选效果的影响,某些抗代谢产物在培养基中只有很短的半衰期。如果有关的细胞系生长很慢，那么抗代谢产物可能在敏感细胞死
16、亡前降解。因此，敏感的变异体可能在不允许其生长的条件下存活下来。生长缓慢的细胞也容易发生染色体数目和结构的变化，这些变化可能使植株再生困难或不可能再生，尤其是当在培养体中累积了非整倍体时更是如此。,选择压力施加方式对细胞筛选效果的影响,选择压力可一次性施加，也可逐步施加。在有些离体选择实验中，选择压力的施加方式对最终的选择效果可能没有什么影响。但在另一些情况下，选择压力的施加方式直接影响到选择的成败。,3.4.3 细胞诱变,诱变是指通过各种诱变剂的作用，使细胞发生变异的过程。是获得优良植物细胞的有效方法之一。常用的诱变剂有物理诱变剂和化学诱变剂两种。,物理诱变剂：包括X射线、射线、中子、粒子、
17、粒子、紫外线等。紫外线的能量较低，不能引起被照射物质离子化，因而叫做非电离诱变因子，其余物理诱变剂均称为电离诱变因子。物理诱变剂处理方法：外照射；内照射。,物理诱变剂,外照射，即射线由被照射物质的外部透入内部诱发突变。又分为急照射和慢照射。内照射，即放射源引入到植物组织或细胞内使其放出射线诱发突变。常用的方法有浸泡法、注射法和饲入法。,化学诱变剂：根据对DNA的作用特点，主要分三类，包括碱基类似物、烷化剂、叠氮化合物。此外一些抗菌素也可作为诱变剂。在DNA复制时，诱发配对错误。如5-溴尿嘧啶。诱发染色体断裂。如马来酰阱、重氮比氨酸、丝裂霉素C、链霉素C等。改变DNA的化学结构：甲基磺酸乙酯、叠
18、氮化钠、亚硝基胍等。,化学诱变剂,诱变的基本过程,材料的选择,预处理,细胞材料的制备,制备细胞悬浮液,（一）制备单细胞,用于突变体筛选的最理想的材料是单细胞或原生质体，也可用茎尖、腋芽等。目前用得最多的材料是愈伤组织。,材料的选择,采用诱变剂进行化学诱变处理。根据植物种类需对诱变剂的含量、时间进行筛选，选用最适含量、最适处理时间才能收到良好的效果。,预处理,分离植物器官、诱导形成愈伤组织、液体培养基中继代培养，获得小细胞团和单细胞的悬浮培养物。或从器官或细胞培养物游离出单个原生质体。,细胞材料的制备,经预处理的材料用糖液洗净备用。经过过滤、离心沉降，最后获得纯净的细胞悬浮液。,制备细胞悬浮液,
19、（二）预培养,单细胞或愈伤组织经诱变剂和酶处理后活力下降，必须进行预培养。可采用平板培养法，也可采用悬浮培养法。,（三）诱发突变,诱发突变一般采用平板培养法，并在培养基中加入某种选择因子，长时间饲喂培养植物细胞，使其发生拟定目标的突变，反复饲喂需数月时间。细胞诱变处理指用各种物理或化学的诱变因子处理细胞材料，使细胞发生突变。,（四）突变细胞的选择,将在具有选择因子的培养基中培养数月的细胞团，转入不加选择因子的培养基中培养，脱除选择因子。数周后，再转入具有选择因子的培养基上，培养数周后选择能旺盛分裂的细胞团（或细胞株），说明该细胞团具有抗某种选择因子的突变细胞株。,根据期望筛选的突变体特性，向培养基中加入一些胁迫因素，如病菌毒素、盐类、除莠剂、氨基酸类似物等，把细胞接种到这些培养基上培养，结果会发现，多数正常细胞不能生长而死亡，而个别突变细胞则继续生长，形成细胞团。,（五）突变细胞的遗传分析和鉴定,根据诱发突变目标进行生长分析、细胞学观察、性状分析。突变后具备的特点：离开选择压后变异表型保持稳定；自然变异表型发生频率低；突变体中具有相应变化了的基因产物或生理生化代谢上的差异；变异表型能够通过有性繁殖遗传。,突变细胞的主要类型,对氨基酸和氨基酸类似物抗性抗病细胞突变体抗除草剂细胞突变体植物抗盐细胞突变体抗逆细胞突变体高光效突变体营养缺陷型细胞突变体,
