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1、RevertAid第一链 cDNA Synthesis试剂盒#K1621, #K1622质量控制分析证明书#K1621Lot采用100 fg对照 GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和 漠质量认证人：Jurgita Zilinskiene化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物目录页码试剂盒组成2存储条件2产品说明2注意事项3操作步骤6RT-PCR6合成cDNA用于克隆7实验对照8问题分析与解决10试剂盒成分RevertAid第一链cDNA合成试剂盒20次 #K1621100次#K1622RevertAid M-MuLV 反转录酶(200 u*/
2、pl)25 pl120 plRiboLock RNA酶抑制剂(20 u*/pl)25 pl120 pl5x反应缓冲液(250 mM Tris-HCl (pH , 250 mM KCl, 20 mM MgC, 50 mM DTT)150 pl500 pl10mM dNTP混合物50 pl250 plOligo(dT)18 引物 100 pM, pg/pl (15 A260 u/ml)25 pl120 pl随机六聚体引物 100 pM, pg/pl (6 A260 u/ml)25 pl120 plGAPDH正向引物，10pM5 - CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-320 pl20
3、plGAPDH反向引物,10 pM5 - GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG- 320 pl20 pl对照 GAPDH RNAkb 3-poly(A) tailed RNA transcript, pg/pl20 pl20 pl无核酸酶高纯度水mlml* 一个单位的RevertAidM-MLV逆转录酶在37C10分钟将1 nmol的dTMP转化为多核苷酸组分(吸附在DE81上)。* 一个单位的RiboLockRNase酶抑制剂抑制5ng RNA酶A 50%的活性。存储条件试剂盒中所有组分应存储在-20C。对照用RNA可存储于-70C以便长期使用。产品说明RevertAid第一链cDN
4、A合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本试 剂 盒使用RevertAid M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。该反转录 酶可 耐受42-50C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。试剂盒中含有RiboLock重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55C高温。试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA中任何RNA为模板合成cDNA。oligo(dT)18选择性和RNA 3poly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的 mRNA为模板合成cDNA。使用本试剂盒也可采用序列
5、特异性引物。合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。注意事项避免核酸酶污染RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至关重要。RNA很容易被RNA酶A降解，而RNA酶 A广泛稳定地存在于实验室中。试剂盒中的所有成分都经过了无 RNA酶的严格验证并保证不含有 RNA酶。为 防止污染，实验室和所有实验准备工作都必须保证没有RNA酶污染。避免RNA酶污染的常规建议：用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头，或者购
6、买已经证明无核酸酶的实验用具。整个实验过程戴手套，因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。并经常更换手套。使用无RNA酶的试剂，即使是超纯水也要确保无RNA酶（比如#R0581，无RNA酶的高纯度水） 使用RNA酶抑制剂，比如试剂盒中提供的FermentasRiboLockRNA酶抑制剂来保护RNA。试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管子要确保扣严。模板RNA通过标准方法得到的细胞总RNA可用本试剂盒获得第一链cDNA。纯化过的RNA要保证不含有盐， 金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法 去 除掉痕量污染物（然后再用75%冷乙
7、醇冲洗沉淀两次）。如果要进行RT-PCR，模板RNA要确保没有 DNA污染。在进行cDNA合成前，模板RNA必须用无RNA酶的DNA酶I（#EN0521）处理去除掉痕 量DNA。实验过程要设置无RT对照反应，即此对照反应中含有除逆转录酶以外的其他所有RT-PCR 成分（RT-对照）。去除RNA中基因组DNA的实验步骤：1.将以下成分加入到一个无RNA酶的管子中：RNA典10x反应缓冲液（含有MgCl2）1p!DNA 酶 I，无 RNA 酶(#EN0521) *1p! (1u)无核酸酶的高纯度水加到10pl*对于每1胞RNA，不要使用超过1u的DNA酶I（不含RNA酶的）。2. 37C孵育30分
8、钟。3. 加入1皿50 mM EDTA，65C孵育10分钟。在含有二价阳离子（1）而缺乏螯合剂的环境中，RNA 会水解。或者可采用酚/氯仿试剂抽提的方法来替代加EDTA孵育这一步骤。4. 使用制备好的RNA为模板进行逆转录反应。RNA样品品质 在进行cDNA合成前，要先评估RNA的完整性。最经常使用的方法是跑变性的琼 脂糖凝胶，然后用漠化乙锭（简称EB，以下同）染色。如果来源于真核细胞的总RNA在跑完胶后可清晰看到18s和28s rRNA的条带，可认为RNA是完整的。28s rRNA的条带亮度约为18s rRNA的两倍。任何拖尾条带都是mRNA降解的信号。如果这种拖尾条带出现，需要重新提取总R
9、NA样品。为了进行RT-PCR，需要评价纯化的RNA (人类，小鼠或大鼠)的适用性。常用方法是在RT- PCR中设置对照，此对照含有试剂盒中提供的模板RNA和对照用GAPDH引物。GAPDH特异性引物 与人，小鼠，大鼠的GAPDH基因完全互补，RT-PCR扩增后得到496bp的产物。RNA样品用量 ng - 5曜的总RNA或者1 ng - 500 ng的poly(A) mRNA作为模板合成第一链cDNA，此反应可作 为两步法RT-PCR中的起始步骤。使用1曜分离纯化的mRNA作为模板合成的第一链cDNA，可用于第二链合成或者后续克隆反应。 引物 合成第一链cDNA使用的引物可为oligo(dT
10、)18引物，随机六聚体引物或者基因特异性引物中 的任意一种。Oligo(dT)18引物针对具有3poly(A)尾巴的真核mRNA。随机六聚体引物适用于总RNA(rRNA 或者mRNA)。因此，相对Oligo(dT)18，使用随机六聚体引物会得到更复杂的第一链cDNA混合物，这 样会降低后续PCR实验的特异性和精确性。但是随机引物在以下几种情况中是有优势的：比如没有 poly(A)尾巴的mRNA或者使用富含poly(A)结构的RNA为模板。基因特异性引物用于从总RNA或者 mRNA混合 物中合成特异性的某条或者几条cDNA，这种特异引物需要使用者自己提供。第一链cDNA合成过程 第一链cDNA合
11、成可进行单样本反应，可以使用不同的模板平行进行多样 本反应。因此，准备反应混合物可每种反应组分单独加入，也可使用master mix(master mix含有除去模板RNA的以外的其他反应组分)。取决于RNA模板结构的情况，将变性和退火分开操作可能会提高RT-PCR的特异性和精确度。下面图表描述的是第一链cDNA合成的主要步骤。详细步骤请见第六页。图表中描述了包括RNA 变性步骤的单样本反应和使用不同模板的多样本反应流程。与单样本反应相比，多样本反应采用相同 的 反应体系(20ul)和相同的试剂用量，但试剂的加入顺序有所不同(见下图)。. ，；，；，；，；，；，,， - , 、，图表1.合成c
12、DNA的单样本反应和多样本反应的实验过程概述右* 单样本反应闩 RN r 又， 丁 1 ，,，*，. * . *A* , f -:八八，八，八，八 . .* .“C，H八,有dT . LL1V - -U、f ,.，、f，八、f ，、4，lVAV*V*V*V*VAVAV.*VAVAVAVAVAVAy.V.V.V?.V/A*AV.V.V*V*.V*V*S-*.V*VXV*.VXV*V*V -, V ”2*;，x，、N* : w，.*,、* w *T- 4* *- 4* *”.,，.八 八八八八八八八八,I z .I、 r、- .)ts 、，.、， 夕 k 二* k-z KT7、/7Z?lII /I
13、X I z i 1 z /AA/.,., . /寸：二L驾旅踌彩沁、丑W快:、.i - - - - - - - - - - - -.1j*Na，和引物加到#（共神）在42C下孵育60分钟（对于随机引物）在70C下孵育5分钟终止反应操作步骤开始前请先阅读第3-5页的注意事项。RT-PCRI. 第一链cDNA合成 融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心， 离心后置于冰上。1.在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加入下面的反应物。模板RNA总RNA或者 poly(A) mRNA或者特异性RNAng - 5 曜10 Pg -曜Pg -院引物oligo (dT)18 引物 随机六聚体引物 基因
14、特异性引物1 p!1 pl15-20 pmol无核酸酶的高纯水到 12pl总体积12pl2. 可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，将模板和引物的混合液轻轻混匀， 短暂离心，65C孵育5分钟，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却。3. 将下列组分按照顺序加入5X Reaction Buffer4 plRiboLock RNA 酶抑制剂(20 u/pl)1 pl10 mM dNTP Mix2 plRevertAid M-MuLV 逆转录酶(200 u/pl)1 pl总体积20 pl4. 轻轻混匀，离心。5. 如果使用oligo(dT)18或者基因特异型引物，42C孵育60分钟。如果使
15、用随机六聚体引物，25C.先孵育5分钟，随后42C孵育60分钟。注意：高GC含量的模板反应温度可升高至45C。6. 70C加热5 min终止反应。反应产物可直接用于PCR反应或者在-20C保存少于一周的时间。如想延长保存时间，建议使用 -70C保存。II.第一链cDNA的PCR扩增 合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50皿 的PCR反应体系中，第一链cDNA反应液加入2pl。TaqDNA聚合酶，PCR Master Mix(2X)或者 PyroStart Fast PCR Master Mix (2X)可用于扩增小于3
16、kb 的片段。DreamTaqDNA 聚合 酶扩增至6kb长的片段。对于20 kb的长片段，建议使用Long PCR Enzyme Mix和 High Fidelity PCR Enzyme Mix。合成cDNA用于克隆I第一链cDNA合成 融化后，将试剂盒中各组分混匀并短暂离心， 离心后置于冰上。1.在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加入下面的反应物。模板RNApoly(A) mRNA或特异性RNA1 Pg Pg引物oligo (dT)i8 引物或随机六聚体引物或基因特异性引物1 pl1 pl100 pmol无核酸酶的高纯水至 12pl总体积12pl2. 可选优化步骤。如果RNA
17、模板GC含量高或者含有二级结构，轻轻混匀，短暂离心，65C孵育5 分钟，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却。3. 将下列成分按照顺序加入5X Reaction Buffer4 plRiboLock RNA 酶抑制剂(20 u/pl)1 pl10 mM dNTP Mix2 plRevertAid M-MuLV 逆转录酶(200 u/pl)1 pl总体积20 pl4. 轻轻混合，离心。5. 如果使用oligo(dT)18或者基因特异型引物，42C孵育60分钟。如果使用随机六聚体引物，25C.先孵育5分钟，随后42C孵育60分钟。注意：高GC含量的模板反应温度可升高至45C。6. 70C加热5 min终
18、止反应。反应产物可直接用于PCR反应或者在-20C保存少于一周。如想延长保存时间，建议使用-70C保 存。II.第二链cDNA合成1. 在冰上将下表的组分加入到20 pl第一链cDNA反应混合液中：10X Reaction Buffer (适用于 DNA 聚合酶 I)8 plRNA 酶 H, (#EN0201)1uDNA 聚合酶 I, (#EP0041)30u无核酸酶的高纯水至 100 pl总体积100 pl2,轻轻混匀，短暂离心。3. 15C孵育2小时。温度不要高于15C。4,加入 u T4 DNA 聚合酶(#EP0061)，15C 孵育 5 min。5,加入 5 pl of M EDTA,
19、 pH (#R1021)终止反应。6,通过酚/氯仿抽提纯化平端的cDNA，以用于的克隆相关实验，比如：接头连接，磷酸化，片段大小分离，连接和转化。实验对照应该采用阴性和阳性对照来验证第一链cDNA合成的结果。无逆转录酶的阴性对照（RT-）在PCR或者qPCR反应中很重要，它可用于评估基因组DNA对RNA样品的污染状况。RT-对照组不含有逆转录酶，但含有实验所需的其他组分。无模板的阴性对照（NTC）对于检测反应试剂的污染情况很重要。NTC对照组不含有RNA模板， 但含有实验所需的其他组分。阳性对照试剂盒中已经提供阳性对照所需的RNA模板和基因特异性引物。人GAPDH对照RNA是通过体外转录方式得
20、到的。GAPDH特异性引物与人，小鼠，大鼠的GAPDH基因完全互 补， RT-PCR后的产物长度大约496bp。下面是阳性对照的操作步骤。I.阳性对照第一链cDNA的合成反应融化后，将试剂盒中各组分混匀并短暂离心，离心后置于冰上。1.在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加入下面的反应物。对照 GAPDH RNA (50 ng/pl)2 plOligo （打辰引物或随机六聚体引物或基因特异性引物1 pl5X Reaction Buffer4 plRiboLock RNA 酶抑制剂(20 u/pl)1 pl10 mM dNTP Mix2 plRevertAid M-MuLV Revers
21、e Transcriptase (200 upl)1 pl无核酸酶的高纯水9 pl总体积20 pl2. 轻轻混匀离心。3. 如果使用oligo(dT)18或者基因特异型引物，42C孵育60分钟。如果使用随机六聚体引物，25C.先孵育5分钟，随后42C孵育60分钟。4. 70C加热5 min终止反应。5. 短暂离心，按照第九页的操作步骤进行对照PCR扩增。II.对照PCR扩增1. 将第一链cDNA合成反应液(第8页)按照1:1000的比例用无核酸酶的水高纯水稀释。2. 其他组分融化后，轻微震荡混匀并离心。3.薄壁PCR管置于冰上，加入下列试剂：从对照 RT 反应得到的 cDNA (1:1000
22、dilution) 2 pl10X PCR buffer5 pl10 mM dNTP Mix1 pl mM each)25 mM MgCl23 pl正向 GAPDH Primerpl反向 GAPDH PrimerplTaq DNA polymerase (5 u/pl)pl无核酸酶的高纯水pl总体积50 pl4.进行PCR反应，PCR仪要有加热的|盖子，或者在PCR管中加入25pl的矿物油。步骤温度,C时间循环数初始变性943分钟1变性9430 秒35退火5830秒延伸7245秒5,将5-10 pl RT-PCR产物上1%琼脂糖电泳。EB染色后应该清晰可见496 bp PCR产物。问题分析与解
23、决存在问题原因和解决办法产物产量低或者没有RT-PCR产物RNA模板降解RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA非常重要。不要忘记在进行cDNA合 成 实验前检测RNA的完整性，真核细胞的RNA在跑完变性胶后可看到18s和 28s rRNA的锐利条带。参考第3页的建议避免RNA酶的污染。模板纯度低RNA纯化过程中使用的一些痕量成分可能会残存在溶液中并抑制第 一链合成，比如SDS，EDTA，胍盐，磷酸盐，焦磷酸盐，聚胺，亚精胺。可采 用乙醇沉淀 方法去除掉痕量污染物（乙醇重新沉淀RNA，再用75%冷乙醇冲洗 沉淀）。RNA模板量不够 模板增加到建议使用量。随后才用DNA酶I处理，在 EDTA存在
24、下（螯合镁离子），加热失活终止反应，具体操作见第3页。在缺乏 螯合剂的加热的环境中，RNA会 水解（1）。引物选择不正确 使用针对RNA模板的正确引物。细菌RNA或者不含有poly （A）尾巴的RNA，使用随机六聚体引物替代oligo（dT晶确保序列特异性引 物与模板的3端互补。模板GC含量高如果模板GC含量高或者富含一级结 构，将反转录温度提高到45C.RT-PCR产物比预计的长RNA模板被基因组DNA污染基因组DNA中的内含子被扩增。在进行反转录之前用DNA酶I进行消化（详见 第3页操作步骤） 为避免基因组DNA的扩增 引物设计在外显子和内含子连接阴性对照中含有RT-PCR产物。八LN，R
25、NA模板被基因组DNA污染PCR产物在RT-阴性对照中表明反应中有基因组DNA污染。在进行反转录之前 用DNA酶I进行消化（具体详见第二页操作步骤）。参考文献1. Wiame, I., et al., Irreversible heat inactivation of DNasel without RNA degradation, BioTechniques,29, 252-256, 2000.RevertAid, RiboLock, PyroStart and DreamTaq 均为 Fermentas 持有的商标。产品使用限制说明本产品用于体外科学研究之用，不可用于诊断或者药物研发，也不可用于人类或者动物体。 请登录查询此产品材料安全数据表。
