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1、TUNE L法检测细胞凋亡1原理TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)是通过检测细胞凋 亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况来评价细胞凋亡的有效方法。细胞凋亡中 染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核 酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30%的染色体DNA在 Ca 2和Mg2依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成 180200bp核小体式DNA片段(核小
2、体式剪切)。由于DNA双链断裂或只要一 条链上出现缺口即可产生一系列DNA的3-OH末端增加细胞膜通透性脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)和 荧光 素(fluorescein )标记的dUTP进入细胞内在TdT的辅助下dUTP与凋亡细 胞中断裂DNA的3-OH末端结合再用辣根过氧化酶(HRP)标记的抗荧光素 抗体与dTUT上的荧光素(fluorescein )特异结合(荧光显微镜观察)一最后用 辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺(DAB)、过氧化氢与HRP发生氧化、环化反应， 形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色特异准确地定位正在凋亡的细胞普通 显微镜下观察和计数不同视野中TUNEL阳性细胞的
3、比例来判断细胞凋亡发生情 况。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成， 很少能够被染色。适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细 胞爬片、涂片)的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双 色法确定细胞死亡类型和分化阶段。2器材与试剂2.1器材光学显微镜及其成像系统、染色缸、湿盒、各种规格的加样器及枪头、镊子、 24孔或6孔板、盖玻片、载玻片、1.5ml eppendorf管、平皿、吸管、锡纸、摇 床、计时表、荧光显微镜、光镜、MARKER笔、冰盒、恒温箱、加湿器、塑料 缸、微波炉等。2.2试剂2.2.1试剂盒内容：ROCHE (10人
4、份)(1 ) 50四l酶浓缩液(TdT-enzyme solution ) 10x 蓝色来源：小牛胸腺，大肠杆菌重组(2) 5501标记溶液(label solution) 1x 紫色，核昔酸混合物 荧光素标记(3) 7001转化剂-POD ( converter-pod) 即用型 黄色，抗荧光素抗体，来源于绵羊的Fab片段，与horse-radish peroxidase 偶联注意：3个试剂用前-20度保存，解冻后就都不能反复冻融，溶解后只能在4 度保存，1和2在4度放1个月或3放6个月应该没问题(有放3近10个月做 的效果还挺好)。1和2绝不能一次配好分装，配好后，哪怕立即冻存下次也不能用
5、了。只能 一次融解，按1： 9用多少配多少，配好后直到使用时要一直放在冰上，余放4 度保存。2.2.2需准备试剂2.2.2.1 一般试剂：双蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、中 性树胶、盐酸酒精、苏木素染液等。2.2.2.2黏附细胞、细胞涂片(1) PBS (pH7.4 )(2) 封闭液：3%过氧化氢-甲醇(新鲜制备)：20ml中含30%过氧化氢2ml，甲醇18ml (有用0.3%过氧化氢-甲醇的)(3) 固定液：4%多聚甲醛-PBS pH7.4 (新鲜制备)：100ml: 4g多聚甲醛溶于 PBS中，定容到100ml，存放在密闭容器中，65度水浴中溶解，4度保存(两
6、周 内使用)。(4 )渗透液:0.1%Triton X100-0.1%柠檬酸溶液(新鲜制备并4度预冷):先配10x 即1%的柠檬酸钠溶液，然后，配20ml渗透液：水17.98 ml + 1%的柠檬酸钠溶 液2ml + Triton X-100 20四1。注意：曲拉通比较黏稠，用加样器吸取后加入时， 不要接触溶液，以免凝成砣样，使含量不足。加入后剧烈摇晃可溶(有用0.2%Triton X100)(5) DAB (新鲜制备)2.2.2.3石蜡包埋组织(1) PBS (pH7.4 )(2 )无核酸酶的 Proteinase K 工作液(10-20 四g/ml in 10 mM Tris/HCl, p
7、H 7.4-8 )(3) 下列3项任选一项：A:渗透液(同上)B：无核酸酶的胃蛋白酶(0.25%-0.5% in HCL，pH2.0 )或胰蛋白酶(0.01N HCL )C： 0.1M柠檬酸缓冲液，pH6.0，微波修复。(4) DAB (新鲜制备)2.2.2.4阳性对照(1) DNase 1 ( 3000 U/ml- 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA)2.2.2.5困难组织(1) PBS (pH7.4 )(2) 0.1M柠檬酸缓冲液，pH6.0，微波修复。(3) 0.1MTris-HCL，pH7.5，含 3%BSA
8、、20%正常牛血清 3操作步骤3.1流程图3.2详细步骤：3.2.1黏附细胞、细胞涂片等3.2.1.1细胞准备及固定（1）准备培养皿、载玻片或盖玻片-取对数生长期细胞-接种培养皿中载 玻片或盖玻片（把细胞液滴在盖玻片上，不溢出四边，待细胞贴壁后再补加液体， 200p液体在37度孵箱内可留30小时，4001液体3天没问题）- 药物等处 理一拿出无菌室，吸弃培养液，37度PBS洗3次（时间不用太长3-5min ） 或 取出载玻片，放入玻璃切片缸内用PBS洗-去净PBS,加新鲜配制的4%多聚 甲醛，室温（15-25度）固定60min （不能用甲醛代替，因市售甲醛中含甲醇） （有固定25min的）。对
9、于细胞涂片：载玻片准备：载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（在载玻片 表面铺上薄薄的一层，晾干，去离子水漂洗，在空气中干燥30-60min，干燥后4 度保存备用（可保存7天）。适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组， 各组离心收集约1X106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻 片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上。放入玻璃切片缸内，加新鲜配 制的4%多聚甲醛，室温（15-25度）固定60min（不能用甲醛代替，因市售甲醛 中含甲醇）。（有固定25min的）3.2.1.2 封闭取出载玻片放入另外玻璃切片缸内，PBS洗3次，摇床上5min -取出切 片，放在湿盒中（用滤纸
10、小心吸去样本区域周围的多余液体，无明显水珠，湿而 不干），滴加3%过氧化氢-甲醇室温作用10min （高浓度的过氧化氢可能会影响 结合力，故可根据实验将其浓度下调，如0.3%）3.2.1.3渗透处理载玻片放回玻璃切片缸内-PBS洗3次，摇床上5min （期间冰箱4度预 冷湿盒）一取出切片，放在湿盒中（用滤纸小心吸去样本区域周围的多余液体， 无明显水珠，湿而不干），滴加渗透液，放入冰箱4度孵育2-5min 3.2.1.4标记反应载玻片放回玻璃切片缸内-PBS洗2x5min （此PBS要预冷，洗在4度冰 箱进行，期间用手摇晃）一 PBS洗的过程中准备标记反应混合物（方法：融解 管1和管2,置于冰上
11、，从管2中取1001用作2次阴性对照，将管1中的501 酶浓缩液加入管2,混匀，置于冰上知道使用，如果一次用不完，用多少配多少， 在1.5的EP管中配）一取出切片，放在湿盒中（用滤纸小心吸去样本区域周围 的多余液体，无明显水珠，湿而不干），滴加标记反应混合物501/片（可根据需 要调整：片大小和细胞多少等。标记所加区域）-37度，避光反应60min （也 有过夜（为防蒸发和保证液体分布均匀可用PE手套或保鲜膜或盖玻片覆盖， 在湿盒内进行不盖也可），阴性对照只加50四1分出的管2溶液3.2.1.5荧光显微镜观察在暗室内用PBS洗2次，每次3min，可用荧光显微镜观察3.2.1.6 POD 转换载
12、玻片放回玻璃切片缸内-PBS洗3x5min -取出切片，放在湿盒中（用 滤纸小心吸去样本区域周围的多余液体，无明显水珠，湿而不干）滴加管3液体 50/片（一定和加标记反应混合物区域一致）37度，避光反应30min （也 有过夜（为防蒸发和保证液体分布均匀可用PE手套或保鲜膜或盖玻片覆盖， 在湿盒内进行不盖也可）3.2.1.7 DAB显色、复染、分化、脱水、中性树胶封片、光镜观察载玻片放回玻璃切片缸内一PBS洗3x5min DAB显色，光镜观察控制 显色，底面出现适量黄色时水洗终止复染、分化、脱水、中性树胶封片、光 镜观察4其它注意事项4.1如果20xDAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重
13、新配制。4.2荧光素标记的dUTP液含甲次砷酸盐和二氯钻等致癌物，可通过吸入、口服 等途径进入机体，注意防护。4.3结果分析时注意：假阴性：个别形式的凋亡可能存在DNA未断裂或断裂不完全；空间阻碍效应（如细胞外基质成分等）阻碍TdT等与DNA断端的接触等。假阳性：坏死后期DNA广泛断裂，增殖过旺盛或代谢过活跃的细胞可 能也有DNA断裂。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小， 胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、 脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状 /凋亡小体）4.4把握好细胞通透的时间，标准：保证酶和抗体进入胞内。4.5 TUNEL反应液时间。一般是37度1h,也可以根据凋亡损伤程度，选择更长 的时间，可长至2h，但要结合最终的背景着色。4.6 PBS的充分清洗，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增 加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
