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1、种子萌发前后蛋白质含量的变化分析操作人：XXX时间：XXXX.XX.XX地点：XXXX温度：16C。实验目的：1、研究种子在萌发前后蛋白质含量的变化，探究萌发过程中各生理指标的动态 变化与植物存在何种关系，进而更深一层了解种子萌发的过程。2、掌握蛋白质含量的测定方法。3、掌握分光光度计的原理及使用方法。4、理解标准曲线的意义及标准曲线的制作方法。实验原理：（1）在碱性条件下，蛋白质中的双缩脲与铜离子作用生成双缩脲络合物（下R-CH R-图）。（2）此络合物将试剂磷钼酸一磷钨酸（Folin试剂）还原，混合物深蓝色（磷 钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。试验方法与过程：1、配制具浓
2、度梯度的标准蛋白质溶液：按下表在试管中加入相应体积的标准牛 血清白蛋白和水，标记相对应的编号。试剂实验编号01122334455标准牛血清白蛋白（ml）/0.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0水（ml）1.00.80.80.60.60.40.40.20.2/2、目的溶液的制备: 取休眠和萌发的种子各十颗，分别加入2ml1%NaCl溶液和少量石英砂 于研钵中，充分研磨成匀浆。 用1%NaCl溶液定容至50ML,摇匀，待再次静止。 取两只2ml的离心管，每管加入1.5ml静置后的溶液，10000rpm离心 3min，取上清液备用。 取4个试管，分别编号为休眠1，休眠2,萌发1
3、，萌发2,分别加入 对应离心后的上清液1ml。3、与碱性铜反应形成螯合物和显色反应 在15只试管中分别加入5ml碱性铜，室温放置10min。 在15只试管中分别加入0.5mlFolin试剂，室温放置20min。4、测OD值：将15只试管中的溶液倒入比色皿，分别测定650nm波长下的 OD值并记录。5、绘制标准曲线：用Excel绘制标准曲线，并求得标准曲线回归方程及R2值。 统计分析标准牛血清白蛋白溶液浓度与OD值是否有显著线性回归关系。原始数据：1、小麦萌发三天的芽长，附图片在在：小麦种子编号12345678910芽长（顷）0.400.500.500.550.500.450.400.400.4
4、00.452、福林酚法测定标准牛血清白蛋白溶液OD值及绘制标准曲线不同浓度标准牛血清白蛋白溶液OD值试管号浓度 C (ug/ml)OD值000.0011500.2321500.21721000.43821000.41331500.56931500.60842000.73842000.78452500.92352500.883测得样本蛋白质溶液OD值如下：样本蛋白质溶液OD值试管编号OD值休眠10.715休眠20.635萌发10.627萌发20.628结果处理与分析：取两次测量的平均值不同浓度标准牛血清白蛋白溶液0D值试管号浓度C ( k s/ml)QD值000. 0011500. 224521
5、000. 425531500. 588542000. 76152500. 905用Excel绘制标准曲线结果如下：标准牛血清白蛋白溶液与0D值标准曲殁标准曲线的回归方程为：y=0.003596x+0.03475,且R20.99,所以所得标准曲线 有效。除了用Excel，还可以用生物统计学来计算线性回归方程，过程如下：泓枫俏/建八并V诰2混十、+护叮顷&二矿&加=邛袂罚、问怦F怜2二。、的时。0灌瑚娜70二况5% =目标$b应b二，项供础彳初?十技仔5可斜二半g1 z诘似早n0十0、球也下面进行线性回归的假设检验计算两组样本溶液各自的平均数，根据标准曲线的线性回归方程，可得到对应 的蛋白质溶液的
6、浓度。经计算，休眠种子样品的蛋白质浓度为179.34g/ml,萌发三天的种子样品的 蛋白质浓度为165.77g/mlo查阅资料，如下图所示，-0.5Mpa为未经特殊处理的小麦种子，即正常萌发的 小麦种子蛋白质含量变化图。该图显示，在萌发第一天到第五天，小麦种子蛋 白质含量上升，第五天之后蛋白质含量下降。而本次实验结果是第三天时蛋白 质含量多于休眠时，可能的原因有： 种子浸泡时间过长 种子在室温下萌发，萌发条件优渥，消耗蛋白质快。以上是种子萌发过程中可能出现的差错，可能性较小，主要出错应该是在 实验过程中。 再研磨休眠种子时因休眠种子过硬，研磨不完全，而研磨萌发种子时 更完全。 在添加碱性铜和F
7、olin试剂时都是先给萌发种子的蛋白质样品添加，所以萌发种子的蛋白质样品显色反应时间长。 在添加Folin试剂后振荡时振荡的力度和时间不一样。Bl Q/GA甘3临营下申*讨论：1、注意事项 及时做好标记。 加入反应试剂后要立即混匀，且等待时间要控制好，不可过长也不可 过短。 研磨时要挑选长势差不多的十颗小麦且去除芽和根。 比色皿中倒入2/3的溶液即可，比色皿表面要擦拭干净。2、经验、心得在加碱性铜和Folin试剂时要由一人完成，不可以为了追求速度两个人完 成，因为两个人移液的速度和振荡摇匀的力度是不一样的，会导致反应的完全 度不一样，从而造成结果的偏差。3、课后思考题 若样品OD值超出标准曲线最大OD值，应先进行样品的稀释再测定 OD值。 测定蛋白质含量的各种方法的优缺点：凯氏定氮法灵敏度低，干扰少，费时太长；双缩脲法灵敏度低，不同蛋白质显色相似；福林酚法灵敏度高，耗时长，操作要严格计时，颜色深浅随不同蛋白 质变化；考马斯蓝法灵敏度最高，干扰物质少，颜色稳定，颜色深浅随不同蛋 白质变化。
