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1、第四章 植物遗传转化技术,植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源基因，获得使外源基因稳定表达的可育植株的过程。,植物遗传转化,植物遗传转化方法,植物遗传转化常用的方法,1、载体法转化农杆菌介导法（Ti质粒）2、非载体介导的遗传转化（1）基因枪法（2）超声波法（3）脂质体法（又称融合法）（4）电转化（5）花粉管转化,将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430 m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶片等，但进去的DNA片段整合效率极低。,1 基因枪转化法,将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬
2、浮液中，混合物在 200-600V/cm 的电场中处理若干秒，然后将原生质体在组织培养基中生长，再生出整株植物。,2 电击法,将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体再生出整株植物比较难。,3 融合法,外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。,4 花粉管导入法,花粉
3、管导入法的特点是直接、简便。受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。,几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型Ti（Tumor-inducing）质粒介导的。,5 农杆菌介导,植物遗传转化载体,作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能：1.它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去，并且整合到宿主细胞的基
4、因组DNA上；2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列。,人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。,农杆菌的Ti质粒,电镜下的根癌农杆菌,冠瘿瘤,1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti质粒。,1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基
5、因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代。Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。,Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质；双股共价闭合的环状DNA分子；T-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表达；长度150-200KB；植物基因工程常用的载体。,根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同分：章鱼碱型（octopine）胭脂碱型（nopaline）农杆碱型（agropine）琥珀碱型（agrocinoine）,章鱼碱的遗传图,胭脂碱的遗传图,Ti质粒结构,T-DNA区、毒性区(vir)、
6、质粒复制起点(ori)、质粒结合转移位点(con)、冠瘿碱分解位点(ocs or nos),Ti质粒结构,Vir区（毒性区）：与T-DNA区彼此相邻，约占Ti质粒总长度的1/3；该区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现毒性；Vir区段总长度约35kb，由7个互补群组成；毒性区中各位点的表达情况分为两种：组成性表达植物诱导性表达,Vir基因的功能：诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上 VirA蛋白；产物诱导T-DNA形成单股DNA片段-VirD蛋白；将T-DNA转入植物细胞，整合到寄主基因组中-VirD、E蛋白；T-DNA基因被表达，使植物细胞增
7、殖并产生冠瘿碱。,T-DNA（Transfer DNA）是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到植物细胞的一段DNA；T-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是T-DNA的边缘区。LB；RB在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口，单链T-DNA进入植物细胞,损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。,Ti 质粒致瘤的分子机制,T-DNA的染色体整合机制,T-DNA的染色体整合机
8、制,天然Ti质粒存在的缺陷,中间表达载体的特性,卸甲载体,构 建,存在缺陷,Ti质粒分子量过大，一般在160240kb，在基因工程中难以操作；很难找到单一的酶切位点；生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物；Ti质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，不能在大肠杆菌中复制。Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。,1、除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；2、除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长
9、；3、除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；4、安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；5、安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；6、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。,Ti 质粒的改造,Ti质粒的改造-去除致瘤基因Onc,由于影响植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，即“卸甲”、“解除”、“缴械”其“武装”的Ti载体，记为Onc-，构建的Onc-载体叫“卸甲载体”。卸甲载体：构建无毒的Ti质粒载体例：pGV3850:是从胭脂碱Ti质粒PT
10、IC58衍生而来的,卸甲载体,中间表达载体,中间载体：带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒的衍生载体称为”中间载体”原理：大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性 目的：把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒中。,中间表达载体：是由中间载体（含选择标记）加上能在植物细胞中表达的启动子及目的基因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后构成。嵌合基因（chimeric gene）就是来自两种或两种以上生物的启动子、结构基因、终止子连接在一起构成基因。,中间表达载体-启动子及调控序列,Ti质粒 Nos、Ocs等基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物细胞中表达，并
11、且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，其中以Nos启动子（pNos）最常用。CaMV的35s启动子 花椰菜花叶病毒DNA的CaMV的35s启动子能使嵌合的外源基因在植物细胞中表达。,为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的新物种。,目的基因,中间表达载体-选择标记,供植物转化体的选择标记：新霉素磷酸转移酶基因(npt)卡那霉素抗性基因(kanr)潮霉素B磷酸转移酶基因，可抗潮霉素(hygr)氨苄青霉素抗性(Ampr)四环素抗性(Tcr)庆大霉素抗性(Genr),Cat（氯霉素乙酰移酶基因）Cat也是应用得较多的一种报告基因。它来自细
12、菌转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因的结构基因。,植物遗传转化载体系统,一元载体转化系统,这类载体是中间表达载体与改造后的受体Ti质粒之间，通过同源重组所产生的一种复合型载体。一元载体系统目前主要有两种载体：,一元载体转化系统-共整合载体,共整合载体的特点是：中间表达载体与受体Ti卸甲载体，通过同源重组共整合而构建；中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是pBR322,外源基因插入pGV3850的过程,中间载体,共整合载体,一元载体转化系统-拼接末端载体,拼接末端载体（sp1it-end vecter,SEV）1985年建立的，因它的两个LIH序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名。,一元载
13、体转化系统-pGV3850与SEV比较,共同点:两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组而形成，故同属于一元载体系统。不同点：受体Ti质粒与中间载体的结构不同。同源序列不同。SEV是更有效的共整合载体。,共整合转化程序,一元载体转化系统-特点,由两个质粒（E.coli质粒和Ti质粒）重组而成，分子量较大；共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低；必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测；构建时比较困难。,双元载体转化系统-概念,是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活
14、T-DNA转移,故称之为反式载体（trans vecter）。,双元载体转化系统,基于T-DNA转移机制的两种特点：对T-DNA转移和整合到植物染色体中起顺式作用的仅仅是其末端24个重复序列。能引起T-DNA转移和整合的毒性区(vir)基因产物起反式作用，即Vir基因不必与T-DNA末端重复序列位于同一质粒上，可由另一种质粒提供。,双元载体转化系统-穿梭载体,穿梭载体(shuttle vector)是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制，又能在真核生物中复制的载体。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(AR
15、S)以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.,双元载体转化系统-穿梭载体,穿梭载体-微型Ti质粒,双元载体转化系统-卸甲载体,含有Vir区段的Ti质粒称为辅助Ti质粒，其主要作用是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T-DNA转移。,将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒；以上述重组农杆菌感染植物细胞。,二元整合转化程序,双元载体系统转化过程,一元载体系统和双元载体系统的比较,一、双元载体不需要共整合过程：系统中的两个质粒不必
16、含有同源序列，构建的操作步骤比较简单。插入载体的外源基因变异小。,一元载体系统和双元载体系统的比较,二、穿梭质粒 具有E.coli质粒的复制位点，能在农杆菌的寄主中复制，使其质粒的拷贝数增加10100倍 分子量小（10kb），可以直接进行体外遗传操作。转移到农杆菌比较容易（转化效率高），而且构建的频率较高。,一元载体系统和双元载体系统的比较,三、一元载体稳定性较好共整合载体构建成功后，工程菌的稳定性较好，双元载体稳定性较差，容易丢失。,载体构建中常用的报告基因,报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。,载体构建
17、中常用的报告基因,报告基因的作用对在选择剂条件下再生的植株或组织乃至细胞作进一步的筛选确定其是否属于真正的基因转化体；是在转化系统中通过瞬时表达检测来确定转化是否成功，或检测转化的基因是否能在转化细胞中得到表达；被用于启动子表达特性的评估和亚细胞区间的研究分析等。,载体构建中常用的报告基因,必须具备以下五个条件：已被克隆和全序列已测定；编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；基因较小，可构成嵌合基因；能在转化体中得到充分表达；检测容易，并且能定量分析；,冠瘿碱opine基因 Nos和Ocs基因不在细菌中表达，故它们在植物组织中的出现，通常是转化已发生的很好证据。优点：检测和分析非常快、简单和廉价缺
18、点：受伤的植物组织有时能产生冠瘿碱,Ti质粒来自细菌（原核）系统，为何其基因能在真核生物中表达？证据一.T-DNA的基因不含有内含子，几乎每个基因的翻译起始位点都是AUG；证据二.无论是胭脂碱合成酶基因nos还是章鱼碱合成酶基因ocs的5末端都具有真核特有的TATA-box,CAA-Tbox；证据三.T-DNA产生的mRNA均是典型的植物mRNA分子。,植物遗传转化实验操作过程,农杆菌的活化,挑单克隆,摇床培养,测OD600,收集细胞,用液体LB培养基重悬细胞,将预培养的外植体放入菌液中共培养,100rpm,30min,取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液,共培养,在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽,生根，形成转化植株,
