《疫血清学技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《疫血清学技术.ppt（35页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、免疫血清学技术,用于检测抗原或抗体的体外免疫反应技术或称免疫检测技术，这一类技术因一般都需用血清进行试验，通常称为免疫血清学反应或免疫血清学技术,第四讲,一、凝聚性试验,抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质存在下，相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或沉淀物，根据是否产生凝聚现象来判定相应抗体或抗原，称为凝聚性试验根据参与反应的抗原性质不同，分为由颗粒性抗原参与的凝集试验和由可溶性抗原参与的沉淀试验二大类,（一）凝集试验,细菌、红细胞等颗粒性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验(agglutination test)。,参与凝集试验的抗体
2、主要为IgG、IgM。凝集试验可用于检测抗原或抗体。凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式分为直接凝集试验（简称凝集试验）和间接凝集试验。,直接凝集试验,颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集现象的试验称作直接凝集试验(direct agglutination test)玻片法：定性试验，适用于新分离细菌的鉴定或分型 试管法：定量试验，检测待测血清中是否存在相应抗体和测定抗体含量,间接凝集试验,将可溶性抗原(或抗体)先吸附于一种与免疫无关的，一定大小的不溶性颗粒(统称为载体颗粒)的表面，然后与相应抗体(或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝集反应称为间接凝集反应。敏感性高，但特
3、异性较差,可溶性抗原,细菌、立克次氏体及病毒的可溶性抗原原虫、吸虫、丝虫的浸出液动物的可溶性物质激素及各种组织器官浸出液植物性蛋白质如花粉浸出液等某些细菌的可溶性多糖,常用的载体颗粒,有红细胞(“O”型人红细胞，羊红细胞)、聚苯乙烯胶乳颗粒，白陶土、离子交换树脂、火棉胶致敏颗粒：载体吸附了可溶性抗原,间接血凝试验,将抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集，称为间接血凝试验(passive heamagglutination assay,PHA)将抗体致敏于红细胞表面，用以检测检样本中相应抗原，致敏红细胞在与相应抗原反应时发生凝集，称为反向间接血凝试验(rev
4、erse passive heamagglutination assay,RPHA)。,乳胶凝集试验,聚苯乙烯乳胶是利用化工原料聚苯乙稀经过乳液聚合得到的高分子乳胶液，乳胶微球直径约0.8m。对蛋白质、核酸等高分子物质具有良好的吸附性能。利用聚苯乙烯乳胶的微球作载体，以吸附某些抗原(或抗体)，即能用以检测相应的抗体(或抗原)，称为乳胶凝集反应。(latex agglutination test),协同凝集试验,葡萄球菌A蛋白(staphylococal protein A，简称SPA)是大多数金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种哺乳动物IgG分子的Fc片结合。SPA与IgG结合后，其Fab
5、片暴露于外，并保持其抗体活性。当此被覆着特异性抗体的葡萄球菌与相应的抗原结合时，就可互相连结引起协同凝集反应，简称COAG。,（二）沉淀试验,可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验(precipitation test)。,抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，抗原分子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结合的总面积大，故在作定量试验时，为了不使过剩，通常稀释抗原，并以抗原稀释度作为沉淀试验效价。参加沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。,环状沉淀试验,在小口径试管内先加入已知抗血
6、清，然后小心沿管壁加入待检抗原于血清表面，使之成为分界清晰的两层数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。本法主要用于抗原的定性试验，如炭疽病的诊断(Ascoli试验)。试验时出现白色沉淀带的最高抗原稀释倍数，即为血清的沉淀价。,琼脂免疫扩散试验,琼脂的作用抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，当二者在比例适当处相遇，即发生沉淀反应，形成肉眼可见的沉淀带，此种反应称为琼脂免疫扩散，又简称琼脂扩散和免疫扩散。单向单扩散 单向双扩散双向单扩散 双向双扩散,免疫电泳技术,免疫电泳对流免疫电泳火箭免疫电泳,二、标记抗体技术,抗体、抗原分子小，在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。将特殊物质标记在
7、抗体分子上，通过检测标记分子来显示抗原抗体复合物的存在，即根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术(labelled antibody technique)。,高敏感性的标记分子,荧光素酶分子放射性同位素,荧光抗体技术酶标抗体技术同位素标记技术,（一）荧光抗体标记技术,fluorescent-labelled antibody technique是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。,荧光色素,是能够产生明显荧光，并能作为染料使用的有机化学物称为荧光色素或荧光染料。可用于标记的荧光素有异硫氰酸荧光素(F
8、ITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC),染色原理及方法,FITC含有异硫氰基，能与IgG分子自由基结合，形成FITC-IgG复合物，且不影响结合抗原的能力和特异性，因此，当荧光抗体与抗原结合后形成有荧光性的抗原抗体复合物常用直接法与间接法 将SPA标记FITC制成FITC-SPA,（二）酶标抗体技术,根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立起来的免疫检测技术。基本程序：标记抗原抗体复合物底物根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。,用于标记的酶,用于标记的酶有辣根过氧化物酶(Horserad
9、ish peroxidase，HRP)、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶HRP的作用底物为过氧化氢，催化时可使供氢体产生一定颜色邻苯二胺(OPD)，显色呈橙色，492nm四甲基联苯胺（TMB），显色呈蓝色，450或650nm3，3二氨基联苯胺(DAB)。反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物。,酶联免疫吸附试验(ELISA),ELISA是当前应用最广、发展最快的一项新技术。其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。,固相载体：聚苯乙烯微量滴定板（珠），硝纤膜 包被：牢固的吸附在载体表面，保持免疫原性 可溶性物质或蛋白质
10、抗原易包被 较大的病毒、细菌需打碎或提取抗原 用于包被的抗原或抗体需要纯化 包被的蛋白质浓度通常为110ug/ml 0.1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液包被 4过夜或3723h，4 或-20 保存,ELISA实验中的影响因素,洗涤：PBST试验方法 ELISA的核心是利用抗原抗体的特异性吸附，在固相载体上一层层地叠加底物显色 结果判定,试验方法主要有以下几种,BA-ELISA:抗原、待检血清、生物素化的二抗、酶标生物素BAB-ELISA:抗原、待检血清、生物素化的二抗、亲和素、酶标生物素ABC-ELISA:抗原、待检血清、生物素化的二抗、酶标记亲和素与生物素复合物Dot-ELISA,免疫组
11、化染色技术,标本制备和处理：组织切片、压片、涂片、细胞盖片；消除内源性过氧化酶染色：间接法、直接法显色观察,（三）放射免疫测定（RIA）,将同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反应的高度特异性结合起来而建立的免疫分析技术可定量分析，也可定性分析特异性强、灵敏度高、准确性和精密度好,三、中和试验,根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验称为中和试验。主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清的质量评价和检测动物血清中的抗体等。,中和试验分为2种,终点法中和试验(endpoint neutralization test)固定病毒稀释血清
12、法：测定病毒毒价；固定病毒稀释血清接种细胞或动物，计算中和价 固定血清稀释病毒法：固定血清稀释病毒接种细胞或动物，计算LD50，然后计算中和指数（中和组LD50/对照组LD50）,空斑减少试验(plague reduction test)：空斑数减少50的血清量作为中和滴度 病毒稀释成每一接种剂量含100PFU，加倍比稀释的血清，37 1h 接种细胞 加入预温的营养琼脂 计算空斑数,四、其他检测技术,免疫转印技术（immunoblotting）免疫沉淀（immunoprecipitation）化学发光免疫测定（chemiluminescent immunoassay，CLIA）胶体金免疫检测技术,免疫血清学技术的应用,动物疫病的诊断微生物的鉴定免疫增强药物和疫苗研究生物活性物质超微定量,
