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1、临床感染症病原体的检验,有无感染？,临床微生物室的核心任务,分离和鉴定真正的病原菌提供最接近真实的药敏结果提供细菌耐药性监测数据及参与院感监测,临床微生物检验的思路与原则1、确保分析前质量2、全面了解机体的正常菌群3、保证检验质量4、微生物定性、定量和定位分析5、加强与临床联系,分离和鉴定真正的病原菌,标本的留取 选择有意义的标本种类（血液）合格的标本 Garbage in=garbage out标本的处理和接种培养的处理和分析,为什么强调标本的采集和运送？,有资料显示，微生物室的误差71%是实验前因素造成的采集、运送那些能真正反映病人状况的标本到医学实验室鼓励送检有价值的标本,鼓励送检有价值
2、的标本,什么是有价值的标本？组织和无菌体液（血、骨髓、脑脊液、关节液、胸腹腔穿刺液）标本进行细菌学检验，有很高的诊断价值，鼓励多送检。尿培养有助于尿路感染的诊断，鼓励送检。痰培养诊断价值有限，在考虑下呼吸道感染（CAP、HAP）时可以送检。口腔和肠内容物、直肠周围脓肿、褥疮、多毛 的脓肿、恶露、呕吐物等价值较低，一般不做细菌培养。,正确、规范采集和运送标本,标本的采集和送检六原则,避免杂菌污染,不同期不同标本,用抗生素以前,采集病变明显部位,运送注意保存,标本必须新鲜,全面了解机体的正常菌群,正确评价细菌培养结果,血及无菌体液培养阳性有重要的临床价值，关键是防止皮肤寄生菌或环境引起的污染。严格
3、的消毒和无菌操作技术非常重要。-首先用70%酒精擦拭静脉穿刺部位待30秒钟以上。-然后用碘酊或碘伏棉签消毒皮肤（1%-2%碘酊30 秒或10%碘伏消毒60秒），从穿刺点向外以1.5cm-2cm直径画圈进行消毒。-最后用70%酒精脱碘。-对碘过敏的患者，只能用70%酒精消毒，消毒60秒 待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血。,正确评价细菌培养结果,尿培养有助于尿路感染的诊断，关键是留取合格标本(105CFU/ml)采取清洁中段尿，注意标本留取-女性患者：清水和肥皂清洗会阴部，不用消毒剂，用 手指将阴唇分开排尿-男性患者：病人翻开包皮冲洗后排尿 应连续排尿 不要间歇排尿,正确评价细菌培养结果,痰培养经
4、常被用于诊断下呼吸道感染引起感染的病原体很多，能在人工培养基上生长的病原体较少感染菌受到抗生素攻击、白细胞吞噬、黏液包裹等因素的影响，活力下降，难以培养引起下呼吸道感染最常见的机制是吸入定植菌，人体口咽部定植菌的种类和数量随机体的健康状况和所处环境的不同而有所不同痰培养结果必须结合临床情况综合评估，价值有限,正确评价细菌培养结果,普通粪便培养仅接种SS（或麦康凯）平板，仅能培养 出沙门和志贺菌，夏季肠道门诊标本加做弧菌培养。引起肠道感染的病原菌有致病菌和条件致病菌常见的肠道致病菌有：沙门、志贺菌、霍乱弧菌、致病性大肠等常见的条件致病菌有：难辨梭菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等。住
5、院3天后出现的腹泻，可能是抗生素相关性腹泻，不 建议做普通细菌培养。,正确评价细菌培养结果,女性阴道与宫颈分泌物标本不常规接种血平板做普通细菌培养因为引起女性生殖道感染的病原体多数不能通过普通的细菌培养获得应根据临床症状选择相应的检测方法-脓性白带（淋病）：淋病奈瑟菌培养；-稀薄、淡黄色、泡沫样白带（滴虫性阴道病）：镜检观察虫体-外阴搔痒，豆腐渣样分泌物（真菌性阴道病）：白带镜检查真菌 孢子和菌丝-乳白色均质分泌物（细菌性阴道病）：镜检线索细胞，生化检查,正确评价细菌培养结果,引起人类感染的微生物种类繁多，生物学特性各异没有一种检测方法能检测所有的微生物，更没有一种培养基能解决临床所有问题主动
6、了解患者病史，根据临床症状和初步诊断选择适当的检测方法，才能更好地为临床提供服务检验与临床的合作和交流非常重要!根据药敏试验结果合理选择抗菌药物,血培养的临床重要性,诊断重要性 阳性的血培养结果，不仅能确定证实病人的疾病是由于感染病原菌引起，更重要的是还可以提供病原菌对抗菌药物的敏感性结果，从而优化抗感染治疗。预后重要性 血培养中一个临床重要的病原菌，表明宿主原发感染部位的抵抗力下降，机体不能清除病原菌或根除感染灶。从血液中培养得到病原菌的种类，同样也对预后有重要的意义。CLSI M47A-Principle and procedures for blood cultures,细菌血症和真菌血
7、症-直接威胁患者生命的感染性疾病,阳性的血培养报告应被视为潜在的医疗紧急状态（危急值）。发展为败血症的比率高达40%-90%。血培养阳性的患者应尽可能快地给予其适当的抗感染治疗。,血培养采集指征,发热（38C）或低温（36C）寒战白细胞增多（计数10，000109/L，特别有“核左移”现象出现，即可见未成熟的白细胞或杆状核白细胞）血液病患者出现粒细胞减少（成熟的多形核白细胞 1000109/L）血小板减少,血培养采集指征,皮肤粘膜出血血压降低昏迷多器官衰竭呼吸加快降钙素原升高（PCT）C反应蛋白升高（CRP）,血培养采集时间,采集时间,chills,Bloood culture,寒战或发热初期
8、采集超过发热峰值后，病原菌的检出率会随之降低。,CLSI M47A-Principle and procedures for blood cultures,采血套数及血量,每次采集2-3套标本，每套应包括一个需养培养瓶和一个厌养培养瓶一个静脉穿刺点只能采集一套血培养，采集第二套血培养应该选择第2个静脉穿刺点成人病人决不能只采集1瓶血培养标本，采血量不足和只做1套血培养所得结果是不易正确解释的,CLSI M47A-Principle and procedures for blood cultures,血培养采集套数,同时从不同部位采集23套注意：1“套”是指一次静脉穿刺尽可能短时间内采集23套此
9、后的25天内不必重复采集,CLSI M47A-Principle and procedures for blood cultures,血培养采集套数,例外：感染性心内膜炎：持续性菌血症间隔30-60分，连续采集3套；监测24小时，如阴性，则再采集2套。血培养结果对诊断和治疗感染性心内膜炎的患者至关重要。,Bacillus subtilis,每次采集血培养的间隔时间？,1.每份血培养间隔应不超过5分钟，因为网状内皮系统对于一过性菌血症和间歇性菌血症在1530分钟内可清除（CLSI规定每份血培养应同时获得，或尽可能短的时间内）2.对怀疑亚急性感染性心内膜炎，间隔1小时，连续采集3份血培养,采集血量
10、,成人患者，每套采集2030ml（病原菌的阳性培养率与血量成正比）。婴幼儿患者，采血量不超过患者总血量的 1。CLSI M47A-Principle and procedures for blood cultures,血量分布,1个需氧瓶+1个厌氧瓶=1套 2个需氧瓶=1套 无厌氧瓶时 采血量不足，保证需氧瓶的量，剩余注厌氧瓶 保证需氧瓶？厌氧菌感染较少 使用厌氧瓶？需养和厌氧瓶搭配的培养可以培养出更多的葡萄球菌、链球菌、肠杆菌科细菌和厌氧菌。CLSI M47A-Principle and procedures for blood cultures,几种常见皮肤消毒液,乙醇、异丙醇（作用30s
11、）葡糖酸氯已啶（作用30s）过氧化氢（作用30s）碘酊（作用30s）碘伏（作用1.5-2min）含有碘的消毒剂需要足够的时间消毒表面,CLSI M47A-Principle and procedures for blood cultures,皮肤消毒方法,血培养瓶消毒：70异丙醇（或酒精）消毒血培养瓶橡胶塞，自然干燥皮肤消毒：先用70异丙醇（或酒精）清洁，空气中晾干，接着使用主要消毒剂并采用推荐的消毒时间2个月儿科患者：葡萄糖酸洗必泰2个月儿科患者：70异丙醇*不管选择哪种皮肤消毒剂，必须保证足够的消毒时间 CLSI M47A-Principle and procedures for bloo
12、d cultures,血培养瓶应孵育多久？,仪器对于绝大多数阳性血培养检测5天是足够的（CLSI推荐全自动系统只需孵育5天）与孵育7天相比，只有0.3%有临床意义的阳性血培养在5天内不能检出。因此设定5天为孵育周期是最为有效的Huang,et al.,European Journal of Clinical Microbiology 17:637.1998只有0.5%有临床意义的阳性血培养在5天内不能检出；5天内所有心内膜炎患者的菌株都能检出(Cockerill,et al.CID 2004),血培养结果报告,初步的书面报告 革兰染色的结果 初步鉴定 根据菌落形态和显微特征，实验室操作 规程的
13、初步检验结果等 药敏数据最终的书面报告 革兰染色的最终结果 最后的确定 最后的药敏数据,血培养的危急值报告,危急值的报告应该尽快（60min内)发出血培养阳性的首次试验结果接受不合格标本时需要一份新的血培养时对初步报告或最终报告结果作任何修改 时；并注明不同于以前的相关细节改变,危急值报告,发报告人全名报告的日期和时间，不论与负责患者的医护人员的联系成功与否接受报告者的全名报告异常值时，要强调该结果是危急值报告接到报告的人“回读”结果记录口头报告危急值后，必须发出书面和/或电子报告,阴性报告培养5日无细菌生长阳性报告培养日有 菌生长阴性报告培养7日无细菌生长,两瓶血培养瓶的结果判断,血培养检出
14、凝固酶阴性葡萄球菌的价值,血培养检出复数菌,常见的菌血症或脓毒血症,1、葡萄球菌菌血症2、肠球菌菌血症3、革兰阴性杆菌菌血症4、厌氧菌菌血症5、真菌菌血症,脑脊液标本的检验,正常人的脑脊液是无菌的一旦感染，病情危急,临床脑脊液常见病原体,脑脊液标本的采集方法,以70%酒精或2%碘酊消毒背部下方，并麻醉之；然后以一特制通管针，轻轻的由第三与第四腰椎间的中线部位穿刺入脊髓蛛网膜，采集约3-5ml脑脊液于3支无菌试管中，每支试管至少1-2ml；然后马上将第2支（或第1支）送至实验室。做脑脊液培养时，建议同时做血培养。腰穿时必须作彻底消毒和无菌操作。,脑脊液标本的运送,常温立即送检，实验室收到标本后应
15、立即接种。脑脊液标本送检的理想时间为15分钟内，半小时送检是可接受的，如果送检时间超过1小时，则会影响结果，在结果报告时，在备注处注明此情况。如不能及时送检，可使用血培养瓶（怀疑脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌感染时，请勿使用血培养瓶）,涂片检查,非常重要,临 床 意 义,1、细菌性脑膜炎（结核性脑膜炎最为常见，肺炎球菌脑膜炎、流感嗜血杆菌脑膜炎及其他革兰阴性杆菌脑膜炎均可发生）2、真菌性脑膜炎 最常见隐球性脑膜炎3、病毒性脑膜炎（乙脑、肠道病毒）,脓 液 标 本,采集方法未破裂脓肿：不能用拭子。消毒覆于脓肿表面的皮肤，用注射器将脓肿内容物吸出。然后切开脓肿、引流，取部分脓肿壁送检。送检时，标本都置于
16、厌氧培养基中。开放病灶和脓肿：尽量去除表面菌群，用拭子采集病灶及底部或边缘的标本，置于需氧培养基中。也可对渗出液作厌氧培养。开放病灶不能做厌氧培养。,烧伤伤口：清创，出现渗出液后以拭子用力采集，仅作需氧培养。也可送检活检组织标本。脓疱或水疱：酒精消毒使之干燥，对于患儿用23号针头挑破脓疱，拭子采集脓疱液和基底部标本。标记：不要只写“伤口”标记标本，应有专门的描述和解剖来源。注明渗出液来自开放伤口还是闭合伤口。,脓液标本中常见的病原体见表2-3,尿 液 标 本的微生物学检验,尿道感染,每年850万例尿路感染,90%为女性1/2.5个妇女在一生中会得UTI下行性感染：血流肾脏膀胱（金黄色葡萄球菌，
17、酵母菌，结核分枝杆菌）上行性感染：尿道膀胱肾盂 血流,尿路感染病原菌,尿培养的培养基,5%血平皿（美国用羊血，欧洲用马血）伊红美兰平皿（EMB）大肠埃希菌为金属绿麦康凯平皿 LF vs NLF 胱氨酸-乳糖-低电解质平皿（CLED）显色平皿(BBL公司的CHROMagar，Hardy BluEcoli Biplate)CUTI（Oxoid公司）;CPSID2（生物梅里埃公司）;UriSelect（Biorad公司）;Rambach;others,尿液运输方法,无需冷藏,尿液革兰染色-革兰阴性杆菌,尿液筛查试验,传统的尿培养,使用校准过的接种环(0.001 or 0.01 ml)垂直插入装有尿液
18、的无菌容器中 在琼脂平板上分区划线：血平皿，麦康凯平皿或CLED平皿大多数尿路病原菌能在血平皿上生长麦康凯平皿有鉴别功能，为革兰阴性杆菌的选择性培养基,尿培养的划线方式,第一区=50,000 cfu/ml第二区=75,000 cfu/ml第三区=100,000 cfu/ml,沿中心线向下=50,000 cfu/ml长向边缘=100,000 cfu/ml,菌落计数的意义,正常尿道口有细菌存在尿液容易受少量细菌污染105/ml菌落计数 104/ml、105/ml建议：重复检查,影响计数的原因,已用抗生素治疗使用利尿药物尿频，尿液在膀胱中停留时间短细菌种类平板上有三种或三种以上细菌生长，判为标本污染
19、，不必计数变形杆菌生长不能计数，应改用CLED或MacConkey平板,痰标本的微生物学检测,标本采集,晨痰方法：自然咳痰法气管镜下采集气管或环甲膜穿刺需避免上呼吸道正常菌群的污染,病原体种类繁多而复杂,使下呼吸道感染病原诊断成为难题,细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）真菌（包括肺孢子菌）病毒支原体、衣原体与立克次体原虫寄生虫,咳痰途经口咽部,唾液中口咽部定植菌的浓度可达108-109/ml。研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。,不可避免地受到污染,涂片检查,合格痰液标本鳞状上皮25个/低倍视野,不合格痰液标本大量鳞状上皮细胞未见吞噬细胞,有意义的细菌浓度值（CFU
20、/ml）,标本,有意义的浓度 CFU/ml,自然咳痰,107,诱导痰,不确定,气管内吸取物,106,支气管肺泡灌洗液,104,保护性毛刷,103,支气管灌洗液,不做培养,气管内吸取物,加等量的N-乙酰-L-半胱氨酸或溶痰剂,漩涡震荡30s,加0.01ml标本至1.0ml的TSB,每个平板涂0.01ml,血平皿,巧克力平皿,麦康凯平皿,1：100稀释,1：2稀释,生长出50个菌落,支气管肺泡灌洗液,将所有标本装入50ml离心管内,离心20min，混匀10ml沉淀液，漩涡震荡30s,每个平板涂0.01ml,血平皿,巧克力平皿,麦康凯平皿,Use pipette.用吸管吸取0.1ml至1mlTSB（
21、1：10稀释）,生长出10个菌落,制作涂片（细胞离心),保护性毛刷,将毛刷置于1ml稀释液中,震荡30s,每个平板涂0.01ml,血平皿,巧克力平皿,麦康凯平皿,生长出10个菌落,Use PRAS if anaerobic若怀疑厌氧菌则使用PRAS,制作涂片（细胞离心),下呼吸道标本的常见细菌,革兰阳性细菌化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌白喉棒状杆菌、结核分支杆菌厌氧菌、放线菌、奴卡菌革兰阴性细菌脑膜炎奈瑟菌流感嗜血杆菌、肺炎克雷白菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、嗜肺军团菌,粪便标本的微生物学检验,肠道中有大量正常菌群应使用选择性培养基必要时（如携带者的检查）进行增菌根据不同
22、季节、人群和临床特征选择检验方法,标本采集,急性期、用药前粘液、脓血便直肠拭子不能立即检验，需要卡-布运送培养基,涂片检验,一般不作直接涂片检查霍乱弧菌、结核杆菌葡萄球菌、艰难梭菌、真菌,培养检查,沙门菌属和志贺菌属 SS平板 无色、透明或半透明、小的或黑色菌落麦康凯无色、透明或半透明、小的选择两个可疑菌落分别接种KIA、MIU,培养检查,霍乱弧菌 TCBS、碱性平板、4号平板致病性大肠埃希菌 中国蓝空肠弯曲菌 弯曲菌选择琼脂菌群失调的检验,常见的致病菌,革兰阴性菌志贺菌属、沙门菌属致病性大肠埃希菌（EPEC、EIEC、ETEC、EHEC）霍乱弧菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌弯曲菌小肠结肠炎耶尔森菌,常见的致病菌,革兰阳性菌金黄色葡萄球菌艰难梭菌白色念珠菌结核分支杆菌,我们应该追求：“准确的病原学诊断”“针对性病原学治疗”正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提！,微生物让人类步步为营，,
