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1、单细胞藻类的培养,一、单细胞藻类的特性,单细胞藻类(Unicelluler algae)，简称单胞藻。因藻体微小，又称微藻（Microalgae）。单胞藻具有利用太阳光能效率高、营养丰富、生长繁殖迅速、对环境的适应性强和容易培养等重要特性，因而受到重视。,通过研究人们发现单胞藻在下列6个方面，可以开发利用：1、作为植物生理研究的试验材料。2、单胞藻的营养丰富，蛋白质含量高，氨基酸的种类组成及配比合理。脂肪含量高，富含动物需要的不饱和脂肪酸。还含有各种维生素和药用成分。可利用为人类的营养食品和健康食品。3、可作为水产动物的饵料和禽、畜饲料添加剂。,4、可利用单胞藻提取色素、药物及甘油等化学产品。
2、5、丛粒藻（Botryococcus braunii Kutzing）含油量一般为干藻重的30%-50%，最高可达80%，是作为能源开发的对象。6、可利用单胞藻光合作用放出的大量氧气和吸收水中的富营养化成分来净化污水和保持良好的水环境条件。,目前，有关海水藻类的培养较多，我国在海水养殖方面，已大规模展开了某些浮游植物的培养，如扁藻（Platymonas spp）、中肋骨条藻（Skeletonema costatum）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、盐藻（Dunaliella spp.）、新月菱形藻（Nitzschia clostertum）、牟氏角毛藻（Ch
3、aetoceros muelleri）及球等鞭金藻（Isochrysis galbana）等，已解决贝类人工养殖的早期幼体饵料问题。在淡水养殖方面，我国只进行了螺旋藻、鱼腥藻、小球藻、栅列藻等的培养。,今后，随着养殖事业的发展，对一些新品种的养殖以及解决某些品种幼鱼的饵料，必然涉及到藻类的培养。因此，有必要了解藻类培养的基础知识。先仅就藻类、主要是单细胞藻类的一般培养方法及有关理论加以简述。,二、单胞藻的生长模式,单细胞藻类在培养过程中，生长繁殖的速度，出现一定的起伏，这种生长模式可划分为五个时期（延缓期、指数生长期、相对生长下降期、静止期、死亡期）,三、单胞藻的培养方式,单胞藻的培养方式，以
4、藻类培养的目的要求而各种各样。但可分为密闭式培养和开放式培养两大类。,1密闭式培养,密闭式培养的目的是不使外界杂藻、菌类及其他有机体混入培养物中。将培养液密封在与外界完全隔离的透明容器中，由此通气、搅拌、输送培养液及调节水温和取样等设备，也都要与外界隔离。培养容器多为管状、也有池状，用有机玻璃或透明的聚乙烯塑料做成水平管道，直立或斜立在地上，暴露阳光或人工光照下。这种培养方式，成本高，好控制，产量亦稳定。,2开放式培养,将藻类培养于敞开的容器（如水泥池、管道、木盆等）中。方法设备较简便，可进行小量或大面积的培养。该法培养物中易发生敌害生物污染，但成本低，使用较普遍，也是今后藻类培养所应采取的方
5、式。,开放式培养可分如下几种类型：开放循环培养：其特点是培养液借助循环水泵而不断循环流动。培养物能循环，就可省却搅拌工作。开放非循环培养：其特点是培养液不循环流动，而定时由小管通入CO2和空气到培养液中；同时也起搅拌作用。此法在大面积培养中使用较普遍。优点是设备简单，无需动力，水泵及大量的CO2及通气设备。半开放循环培养：半开放培养是指培养容器或池、槽等场所虽仍敞开，但有些部分密闭，或用塑料布覆盖。这种培养方式，利用管道，依靠动力，使培养液流动和通入含二氧化碳的空气。该方式设备复杂，但效果较好。,四、培养液的配制及举例,在实验条件下培养单胞藻有多种培养基配方。这些配方大多数是早先发表过的配方的
6、修改方，有些则从分析天然生境的水而得到，有些是从生态角度考虑的。,发展藻类培养的营养配方时主要考虑的问题是：a、盐的总浓度：大多是取决于有机体的生态来源。b、主要离子组分的组成及浓度：他们是钾、镁、钠、钙、硫酸盐和磷酸盐。,c、氮源：硝酸盐、氨和尿素常用作配方中的氮源，根据藻中的性能和pH的最适点而定。藻类的生长主要依赖氮的可利用性。大多数单胞藻干物中含有79的氮。因此在1L培养液中生产10g细胞就至少需要500600mg/L KNO3。,d、碳源：无机碳通常是用含15CO2的空气来供应的，碳的另一种供应办法是用碳酸氢盐。选用何种办法主要是根据藻类生长的pH最适点而定。e、pH：通常用偏酸的p
7、H值来避免钙镁和其它微量元素发生沉淀。,f、微量元素：培养基中的微量元素通常是用早已证明有效浓度的混合溶液来提供的（浓度在ug/L级范围）。然而，这些微量元素的组分对藻类生长是否必须却不能总能显示。为增加微量元素的稳定性，常用柠檬酸盐和EDTA作为螯合剂。维生素：许多藻类要求有硫胺素和维生素B12的供应。,几种常用的单胞藻培养液,1、单细胞绿藻（栅列藻）培养液水生4号（NH4）2SO4 0.200g Ca(H2PO4)2H2O+2（CaSO4H2O）0.030g MgSO47H2O 0.080g NaHCO3 0.100g KCl 0.025g FeCl3（1）0.150mL 土壤浸出液 0.
8、500mL 水 1000mL,水生6号 NH2CONH2 0.133g H2PO4 0.033mL MgSO47H2O 0.100g NaHCO3 0.100g KCl 0.033g FeSO4（1水溶液）0.200mL CaCl2 0.050mL 土壤浸出液 0.500mL 水 1000mL,水生四号培养液中，藻类呈深绿色，生长繁殖速率较低。水生6号培养液中，藻类呈草绿色，色素不够正常，但生长繁殖迅速。土壤浸出液是用田园土壤按水与土2:1的比例，搅匀浸泡后的上层清液，用前煮一小时后镜检，发现污染生物，应再加温消毒后使用。,2浮游硅藻培养液水生硅1（mg/）硝酸氨 120 硫酸镁 70磷酸氢二
9、钾 40 磷酸二氢钾 80氯化钙 20 氯化钠 10硅酸钠 100 柠檬酸铁 5土壤浸出液 20 硫酸锰 2水 1000mL pH 7.0,水生硅2（mg/）尿素 150 氯化钾 30过磷酸钙 50 硅酸钙 100硫酸镁 50 碳酸氢钠 3硫酸锰 3 土壤浸出液 4mLEDTA铁 1mL 水 1000mL,水生硅2号是用化肥尿素过磷酸钙为氮磷来源，适于大量培养硅藻时选用，生长适温为2030；光强为2,0005,000米烛光。,3朱氏10号培养液：适用于培养硅藻、蓝绿藻等。H2O 1000mL Ca(NO3)2 0.04 g K2HPO4 0.01 g MgSO47H2O 0.025 g Na2
10、CO3 0.02 g Na2SiO3 0.025 g FeCl3 0.008 g 使用时按1/2、1/4、1/10稀释使用。,4f/2培养液 硝酸钠（NaNO3）75 mg 磷酸二氢钠（NaH2PO4）4.4 mg f/2微量元素溶液 1mL f/2维生素溶液 1mL 海水 1000mL 本配方适应与目前生产上使用的各种微藻的培养，但用于硅藻培养时，应再加50mgNa2SiO3。,附I：f/2微量元素溶液配方：硫酸锌（ZnSO44H2O）23mg 硫酸铜（CuSO45H2O）10mg 氯化锰（MnCl24H2O）178mg 柠檬酸铁（FeC6H5O75H2O）3.9g 钼酸钠（NaMoO45H
11、2O）7.3mg 乙二铵四乙酸钠（Na2EDTA）4.35g 六水氯化钴（CoCl26H2O）12mg 纯水 1000mL,附II：f/2维生素溶液配方：维生素B12 0.5mg 维生素H（生物素）0.5mg 维生素B1 100mg 纯水 1000mL,五、藻种的分离培养,为了要进行某种藻类的科学研究和大量培养，有必要把某种藻类与其他生物分离。分离培养藻种，可分为两大类:1、单种培养，即藻类虽只有一种，但还混杂细菌。2、纯培养，即不仅藻类只有一种，亦无其它任何生物。纯培养比较困难，一般的分离培养往往只能做到单种培养。,决定培养哪一种藻类，主要根据培养的目的要求，及某一种类的生物学特征。藻类的分
12、离主要有以下几种常用方法。1、离心法：将混合液用离心机离心，水中不同藻体及细菌就以不同的速度下沉，因此得以分开。这样将不同时间下从导管底的藻体取出，经镜检选定某种藻类最多的沉积物，再加清水，继续离心，如此反复就可得到比较单纯的藻体，在接种相应培养液中培养。该法可消除细菌，并增加纯粹分离的可能性，至少可作为藻种平板培养的准备工作。另外，在水液中藻体含量较少时，可用此法集中藻体。但此法不能做到使不同藻类完全分离。,2、稀释法：该法源于中野治房（1933）的方法。用已消毒试管5只，在第一管盛蒸馏水10mL，第25管都装5mL，用高压蒸汽消毒，待冷却后，第1管用滴管滴入混合藻液12滴，充分振荡，使均匀
13、稀释。次用消毒吸管，从第1管中吸取5mL滴入第二管中如前振荡，使均匀稀释。以后依次同样滴入第35管，并都充分均匀稀释。然后把五个已盛又消毒的琼胶培养基培养皿，加热使之溶解，待冷却而尚未凝固时，分别滴入五个试管的藻液各一滴，用力振荡，使藻液充分混于培养基中。待冷凝后，把五个培养皿放在受着漫射光窗口，一直到出现藻群时为止。在20左右时，约10天即出现藻群。用消过毒的白金丝取些藻群，进行琼胶固体培养基的不通气培养。此过程反复多次，直至得到完全分离的纯藻种群为止。此法稀释要使用较多容器分组培养，比较麻烦，但较易成功。,3、微吸管法：将水样在载玻片上滴成绿豆粒大小的一些水滴，这样可使每个水滴中有很少生物
14、而便于分离；在解剖镜下用微吸管（口径小至0.0080.16mm，圆口，可自行拉制）。将要分离的藻体吸出，用蒸馏水或平衡矿物质溶液冲洗数次，然后主导成有培养基的小培养皿中培养，待生长旺盛后，再扩大培养。此法较适用于能运动的藻类。,4、趋向反应法：利用藻类的特殊趋向性（如向光、向地等）不同而分离藻体。此过程反复几次就可得到一定纯度的藻体。分离效果较好，只是不能应用于不运动的藻体。,5、平板分离法：在培养液中加入占培养液1.5的琼胶，加溶解后，注入培养皿中，加盖后用15磅压力121灭菌20分钟，即制成胶质培养基（也可用硅酸胶和明胶制备）。在琼胶培养基放在40以下的水浴锅内，开盖用吸管注入混合藻液，摇
15、匀，使之分散在培养基平面上。之后，可放在恒温箱内，用荧光灯照射，使藻群生长。再经镜检，反复此法不断提纯，即可分离出较纯的藻种。,6、固氮蓝藻分离培养法：将一小片藻丝群接种到培养基上，几天后再用灭菌白金丝挑取生出的新藻丝接种到平板培养基上。这样经几次分离接种就得到较纯的藻种。,六、藻种的选择、接种和保存,1藻种的选择：虽然藻类种类较多，但其中仅少数经过人工培养。应该研究在室外培养其他藻种的可能性和他们生产的潜力，所选择的生物种应具有下列特征：生长迅速；对极端的温度和辐射条件的耐性范围大；蛋白质，脂类和糖类含量高，或有选择地积累一种特殊的代谢产物（如甘油）；无毒性，且易于收获。根据系统的要求和特殊
16、的方法，还可有其他要求。,2接种：在分离到单纯藻群后，就可接种到培养液中进行培养，进而移养扩大培养。接种方法有液体接种和干藻接种。前者是将藻液直接加入培养液中进行搅拌，加入的藻种分量视水温而定，水温较低（10以内）时，多加；约占培养液总量的3040左右，水温适宜时（2530左右），可加58左右。后者若用干藻的藻体接种，接种量为0.10.2。,3藻种的保存：一旦藻种分离得到，就要保存好以便在一定的时间内供接种用。为此，要将藻种消毒，避免其他来源的污染。给以适当的光照和温度。在液体培养中，为了快速增殖，可用5400lx。再得到良好生长后（12周），培养液移到更低的光照条件（5401100lx），以
17、求缓慢生长及储藏。,藻类在琼脂培养基上接种后的藻种，先给予2700lx光照67天，直到得到良好生长，然后移到540800lx光强的地方。大多数藻类保存在室温下（1520）即可，少数藻种存活需较高温度。,藻种接代一次的频率视物种及贮存条件而不同，单胞藻及丝状不运动的物种可以每六个月到十二个月移种一次，有鞭毛的物种移种次数要更频繁些。某些藻种曾成功地做到了在液氮下长期保存。,七、管理及采收方法,1、管理藻类培养的管理包括培养基养料的补给、光照及温度调节、CO2的补给、搅拌、防污等。在培养过程中，补给的养料，要选择肥效速，并有持久性，来源较广，价格低廉的种类。一般都以有机肥料为补肥。,光照、温度的调
18、节视种类及季节而定。室内照光一般都采用白炽电灯和荧光管。温度调节一般采用室内用白炽灯照射培养物或用温室、安装电热管等升温，室外冬季升温较困难，主要采用玻璃棚；用冷水管道降温，或经通风遮阳降温。,CO2的补给一般通过空气压缩机或橡皮管将含5CO2的空气通过培养物中。搅拌是藻类培养不可少的一道工序。搅拌可使培养物均匀分布，水温均匀，利于藻类生长。搅拌的方法一般为人力搅拌、风力搅拌、空气搅拌和磁力搅拌。此外还有循环流动法。,防污在藻类培养中很重要，对杂藻及细菌的防治主要采用石灰、漂白粉、硫酸铜等试剂。用10.5ppmCuSO4防止杂藻的效果较好。当有浮游动物污染时，可施用化学试剂、杀虫剂等杀灭，如硫
19、酸铜12ppm可杀灭轮虫、纤毛虫；漂白粉4ppm对各种虫类均有效；食盐9，可杀灭轮虫；碘液5，再稀释到十万分之一，可杀灭纤毛虫。,2、采收方法,培养物的采收的时间要适当，主要根据其密度大小决定。采收的方法有：（1）物理浓缩：离心法：国外使用最普遍。它利用离心力来把藻体与水液分离，是藻体下沉达到浓缩目的。主要工具是离心机。重力沉降法：利用重力使培养物下沉而得到浓缩物。使用的工具是沉淀器。遮光法和降温法：对趋光性强的藻类，如衣藻等进行遮蔽光线，使培养物下沉而得到浓缩物。低温使藻类也有下沉现象。,（2）化学浓缩法：用沉淀剂如明矾、石灰等，使培养物下沉，而得到浓缩物。明矾0.30.4，将之研碎，加入培
20、养物中搅拌，半小时培养物大部分下沉，在612小时后，全部下沉。石灰一般是将其1斤溶在100200斤水中，制得饱和石灰水，其用量是6。但该两法沉淀的藻浓缩物的灰分较多。此外，较大体积的种类，如丝状体、非浮游性的藻类等可用过滤法采收。采收后的藻浓缩物即可经干燥加工成饲料或其他原料。,八、分析技术,1细胞计数显微镜法 培养物中的个体数测定，是按照个体计数方法，测定和估计培养物单位容积中的个体数。计数方法同浮游植物定量的方法。此外，也可以采用血球计数法。,2分光光度计法：培养物的藻类密度也可用分光光度计测定。当藻类密度较低时，光径中的细胞数与测量到的光密度有一简单的几何关系。在藻类密度不大时，光密度大
21、，细胞数目就多，即可用测得的光密度值表示细胞数目。,3干重测定 测定干重的增加量是生产估测方法中的一个最直接的方法，其步骤如下：取样从藻体培养液中取出有代表性的一小部分体积的藻液。取样时在以下三点上要特别注意：将培养物搅拌均匀快速吸取样品以免沉积足够多的样品,分离取出样品后，用过滤膜过滤或用离心法把藻体与介质分开。细胞必须洗过以除去盐分和其它污物，通常是用稀释的培养液或缓冲液。海洋藻类不能用蒸馏水洗，以免质壁分离和细胞胀破。,干燥选择对特定有机体最适的烘干温度。避免过热有好的重复性对同一样品增烘1小时后，称得统一重量。测定结果的表示法所得干重测定值要以单位培养液体积的干重表示。室外的培养池则用单位照光面积的干重来表示。,九、单胞藻的培养实验,1、池塘藻类的分离培养目的：了解池塘藻类的组成；掌握平板分离法分离藻种；掌握藻类的开放非循环培养方法。思考：应选择什么样的培养基？2、单胞藻的单种培养 将平板分离法分离藻种挑出接种到液体培养基中进行扩增培养。,
