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1、肿瘤免疫及肿瘤标记物检测,一 肿瘤相关基因 二 肿瘤抗原 三 抗肿瘤免疫效应 四 免疫逃逸 五 免疫诊断和治疗 六 肿瘤标记物的检测,肿瘤免疫学Tumorimmunology,是研究肿瘤抗原、机体的免疫功能与肿瘤发生发展的相互关系、机体对肿瘤的免疫应答及其抗肿瘤免疫效应机制、肿瘤的免疫诊断和免疫防治的科学。,一 肿瘤相关基因,细胞癌变过程中发生改变的基因.癌基因抑癌基因调控基因,(一)癌基因(oncogene),是动物细胞及致癌病毒基因组内固有的一段功能单位。正常情况下癌基因表达受严密控制，当胞内调控机制受损时，癌基因可过度激活并异常表达，从而导致正常细胞癌变。,根据其来源可分为 virus
2、oncogene cellular oncogene proto-oncogene,1968年 Duesberg 等首次发现，因基因来自病毒而被命名为病毒癌基因。Rous 肉瘤病毒：基因组“编码酪氨酸蛋白激酶”基因，证实它在细胞转化中起关键作用,存在于正常的细胞基因组中，与病毒癌基因有同源序列，具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。在正常细胞内未激活的细胞癌基因叫原癌基因，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。,存在于正常细胞基因组中未激活的细胞癌基因，是人体正常细胞中的一种正常基因，调控细胞生长和分化。广泛存在于生物界中，从酵母到人类细胞中都存在。,1
3、.蛋白激酶类 2.信息传递蛋白类 3.生长因子及其受体类4.核内蛋白类,(二)抑癌基因 tumor suppressor gene,正常细胞抑癌基因能抑制细胞转化和肿瘤发生。多数肿瘤细胞都存在抑癌基因的改变。抑癌基因的丢失、失活及癌基因的激活与肿瘤的发生、发展密切相关。,主要功能 1 诱导终末分化；2 维持基因稳定；3 触发衰老，诱导细胞程序性死亡；4 调节细胞生长；5 抑制蛋白激酶活性；6 改变DNA甲基化酶活性；7 调节组织蛋白酶活性；8 调节血管形成；9 促进细胞间联系等,目前已被发现并克隆的抑癌基因包括P53、P16、Rb、WT-1、MTS、多发性结肠癌基因等。,(三)肿瘤细胞转移基因
4、 转移抑制基因,肿瘤细胞转移基因的激活和/或转移抑制基因失活均可诱发肿瘤细胞转移表型而导致转移的发生.此类基因本身并不引起正常细胞癌变，而是参与其调控作用。,目前发现,癌基因 有100多个：ras基因家族参与多种肿瘤的形成与发展，82年以来，在膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、及造血系肿统瘤中，均检出了ras癌基因的异常；myc基因参与细胞凋亡，c-myc基因与多种肿瘤发生发展有关。,抗癌基因 有数十个：nm23基因是肿瘤转移抑制基因。p16是比p53更重要的一种新型抗癌基因；SARI参与并抑制一种关键蛋白质，这种蛋白质在90%的人类癌症中都过度表达。转移基因（metas
5、tasis gene）有一些?是直接促进转移发生的关键基因，其存在或表达增强会引起侵袭转移的发生转移相关基因（metastasis-associated gene）有一些?只涉及转移的某个阶段，并非参与整个转移过程。,二 肿瘤抗原,是指细胞癌变过程中出现的新抗原及过度表达的抗原物质的总称。,产生机制,1细胞癌变过程中合成了新的蛋白质分子；2异常糖基化导致蛋白的特殊降解产物；3基因突变使正常蛋白质分子的结构发生改变；4正常情况下处于隐蔽状态的抗原表位暴露出来；5多种膜分子的异常表达；尤其是信号传导分子。6胚胎抗原或分化抗原的异常表达。,研究主要历程,20世纪最初:寻找和证实肿瘤抗原，没取得明显进
6、展 20世纪50年代:纯种小鼠的培育成功，证实了化学致癌剂甲基胆蒽(mcthvl，holanthrene，MCA)诱发小鼠发生的肉瘤所表达的移植排斥抗原是肿瘤抗原，证实了肿瘤抗原的存在。20世纪60年代:证明淋巴、巨噬细胞和抗体等抗肿瘤效应。20世纪70年代:单抗问世，推动了肿瘤免疫诊断技术和肿瘤免疫治疗的发展。20世纪80年代:肿瘤抗原、MHC分子、T杀伤机制等有更深了解。20世纪90年代:多种人类肿瘤抗原基因克隆成功，肿瘤标志物检测，推动了肿瘤免疫学发展。,分类及其特征,按特异性分类 肿瘤特异性抗原（TSA)肿瘤相关性抗原(TAA),TSA 是肿瘤细胞特有的，或只存在于某种肿瘤细胞而不存在
7、于正常细胞的新抗原。又称TSTA或TRA。,TAA是指非肿瘤细胞所特有的、正常细胞和其他组织上也存在的抗原，只是其含量在细胞癌变时明显增高。只表现出量的变化而无严格肿瘤特异性。如：胚胎性抗原,根据肿瘤发生的原因分类,理化致癌剂病毒诱导自发肿瘤抗原胚胎抗原,人类少有；具有明显的个体独特性 特异性高，抗原性弱，为TSA,如MUM-1,特异性弱，同株病毒所诱发的肿瘤具有相同的抗原性。抗原性强。,人类肿瘤抗原多属于此类抗原。可表达TSA，也可表达TAA。,胚胎组织正常成分，出生后消失。细胞恶变后大量出现，可作为诊断的一个重要指标。为TAA.包括 分泌型的 AFP，和膜相关的 CEA,按抗原的基因类型分
8、为,静止基因的表达产物：癌细胞将该基因表达启动，被T识别。分化抗原基因的表达产物：CEA。出生后该基因关闭。细胞癌变后则重新开启该基因，成为免疫系统识别的靶子。癌基因的异常高表达：HER-2某些正常细胞有微量表达，但自身T细胞对其耐受，癌变细胞由于异常高表达打破了这种耐受。突变的抑癌基因产物：如突变p53可造成其产物堆积，为免疫系统识别。突变的癌基因表达产物：正常的ras基因产物无免疫源性，癌细胞中在编码ras第12或61 位发生基因突变，形成具有新表位的p21ras产物，。染色体易位产生的融合基因产物：白血病细胞的原癌基因c-abl 从9号染色体易位到22号染色体与bcr基因连接形成bcr-
9、abl融合基因编码210KD融合蛋白。致癌病毒性基因产物：HPV与宫颈癌密切相关，HPV16的E6、E7基因能使宫颈鳞状上皮转化为癌细胞。而E6、E7的基因产物可被T细胞识别。其他,三 抗瘤免疫效应,机体的免疫监视功能和一般的清除抗原的机制一致细胞免疫作用更大些肿瘤患者的免疫应答不够有效抗癌药物对机体免疫机能有损伤,三 抗瘤免疫效应,体液免疫机制(一)激活补体系统溶解肿瘤细胞(二)ADCC(三)抗体的调理作用(四)抗体封闭肿瘤细胞上的某些受体 例如转铁蛋白可促进某些肿瘤细胞的生长，抗体可通过封闭肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体，从而抑制肿瘤细胞的生长。(五)抗体使肿瘤细胞的粘附特性改变或丧失。有助于
10、控制肿瘤细胞的生长和转移。,肿瘤细胞的抗原呈递,外源性抗原呈递（专职APC提呈）专职APC可捕捉肿瘤释放出的可溶性抗原，从肿瘤细胞表面脱落的抗原或从肿瘤组织脱落的肿瘤细胞，由MHC II类分子呈递给CD4+T细胞。,内源性抗原呈递（肿瘤细胞提呈）瘤细胞自身MHC I类分子将内源性肿瘤抗原肽呈递给CD8+T细胞。肿瘤抗原基因所编码的多肽一般含有多个抗原表位，被MHC I类分子结合并提呈给CTL的短肽是其中极小部分。目前已人工合成肿瘤抗原肽，且已鉴定出一批与人MHC I类分子结合的肿瘤抗原肽。用于肿瘤的免疫治疗。,细胞免疫机制,(一)T细胞1 Th(1)细胞直接杀伤癌细胞。（2）通过其释放的细胞因
11、子如IL2、IFN-等，激活单核-巨噬细胞、NK，并增强CTL的杀伤功能。2 Tc CD8CTL是抗肿瘤免疫的主要效应细胞。（1）直接杀伤肿瘤细胞（2）诱导凋亡（FasFasL）（3）是通过分泌多种细胞因子,(二)NK细胞 是细胞免疫中的非特异性成分，其杀伤特点是：无需抗原致敏、发生早、杀伤作用无肿瘤特异性、无MHC限制性。穿孔素 Fas/FasL ADCC 细胞因子：激活单核-巨噬细胞、诱导Th0Th1/2转化。,(三）树突状细胞：DC是近几年研究的热点。是诱导T细胞抗肿瘤免疫最强的APC 近期研究证实DC可分泌的exosomes（外泌小体）具有抗原呈递密切相关的MHC I、II类分子和共刺
12、激分子。IL-10、IL-12、IFN-可促进DC分泌exosomes。动物实验表明：肿瘤抗原多肽致敏的骨髓DC制备的exosomes可在体内诱导高水平肿瘤特异性CTL，治愈荷瘤小鼠，它有望成为一种新型的肿瘤疫苗。,(四)巨噬细胞 1 释放溶酶体酶：活化的巨噬细胞与肿瘤细胞结合后，通过溶酶体酶等直接杀伤肿瘤细胞，且杀伤作用强弱与溶酶体进入肿瘤细胞数量有关。2 提呈抗原。激活T细胞。3 ADCC效应 4 分泌细胞毒性物质：活性氧、NO、蛋白水解酶等。5 分泌细胞因子：TNF诱导癌细胞凋亡；IL-1、IL-12等激活T细胞,（五）其他细胞 中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞 LAK：淋巴因子激活杀
13、伤细胞 CIK：细胞因子诱导的杀伤细胞 TIL：肿瘤浸润淋巴细胞,四 免疫逃逸,与肿瘤细胞有关的因素1抗原缺失和抗原调变2瘤细胞I类分子表达低下3瘤细胞缺协同刺激信号4封闭性抗体的作用5抗原覆盖6肿瘤细胞产生免疫抑制物（IL-10,TGF-)。7 肿瘤细胞的“漏逸”8 肿瘤细胞抗凋亡（高表达bcl-2，少或不表达Fas及相关分子）,与宿主免疫系统有关的因素 免疫功能低下、免疫耐受状态、宿主抗原提呈细胞的功能低下或缺陷等。,四 免疫逃逸,五 免疫诊断治疗,检测肿瘤抗原：是目前最常用的肿瘤免疫诊断方法。如AFP原发性肝癌，CEA直肠结肠癌，CAl99胰腺癌。检测抗肿瘤抗体：单抗导向显影：放射性核素
14、与抗肿瘤单抗结合后，从静脉注入体内或腔内注射均可将放射性核素导向肿瘤的所在部位，用照相机可以显示清晰的肿瘤影像。检测其他肿瘤标记物：细胞表面分子、基因、蛋白的检测,肿瘤的免疫诊断,肿瘤的免疫治疗,免疫治疗,特异性主动免疫治疗免疫导向治疗细胞因子治疗免疫细胞的过继治疗基因治疗,应用疫苗（由处理过的自体肿瘤、培养的肿瘤细胞或异体肿瘤制成）或基因工程疫苗进行免疫接种，可激发或增强患者特异性抗瘤免疫应答，阻止肿瘤生长、扩散和复发，即SAIT。包括细胞疫苗、分子疫苗、基因工程疫苗。,基因修饰的肿瘤细胞疫苗肿瘤抗原肽或基因修饰的APC疫苗,肿瘤相关的病毒疫苗重组病毒疫苗癌基因产物的分子疫苗抗独特型抗体疫苗
15、热休克蛋白-肽复合物肿瘤疫苗人工合成的肿瘤多肽疫苗,免疫治疗,特异性主动免疫治疗免疫导向治疗细胞因子治疗免疫细胞的过继治疗基因治疗,抗体-药物偶合物导向治疗免疫毒素导向治疗抗体-核素偶联物导向治疗双功能抗体导向治疗抗体-超抗原偶联物或 其融合蛋白导向治疗抗体导向酶解前药疗法以血管为靶标的抗体导向治疗放射免疫导向手术治疗,单克隆抗体治疗,免疫治疗,特异性主动免疫治疗免疫导向治疗细胞因子治疗免疫细胞的过继治疗基因治疗,外源性细胞因子治疗细胞因子导向疗法细胞因子基因治疗,淋巴因子激活的杀伤细胞肿瘤浸润淋巴细胞细胞因子诱导的杀伤细胞其他细胞导入细胞因子基因的效应细胞,应用正常或野生型基因纠正或置换致病
16、基因或导入有治疗作用的其他基因，从而诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答；增强对肿瘤的特异性识别；抑制和阻断肿瘤相关基因的异常表达；增强肿瘤细胞对药物敏感性等。,外源基因,免疫分子编码基因抗癌基因反义核苷酸肿瘤药物相关基因病毒基因,六 肿瘤标记物的检测,传统的蛋白类标记物 DNA标记物和RNA标记物 肿瘤的分子标志物并非绝对特异，彼此之间也非完全一致，需要联合多项指标，动态观察，且需结合临床表现判断。肿瘤标志物血清水平不高，多用标记技术检测,临床常见肿瘤标志物,AFP有助于原发性肝癌诊断CEA有助于直肠癌、结肠癌诊断CA19-9有助于胰腺癌诊断CA125有助于卵巢癌诊断PSA有助于前列腺癌诊断,检
17、测的目的和意义,早期诊断高危人群筛查肿瘤的辅助诊断疗效观察复发检测预后判断,肿瘤标记物的分类,1)肿瘤细胞分泌的标志物(1)分化抗原标志物(淋巴瘤标志物等)；(2)胚胎抗原标志物(CEA，AFP等)：(3)糖脂或精蛋白类(CA-199,CA-125，CA-153，CA-50等)(4)同功酶类标志物(NSE，PAP，IRE，PLAP等)(5)激素类标志物(HCG，ACTH，CT等)(6)肿瘤相关抗原(PSA，SCC，CYFRA-211)(7)基因类标志物(P53基因，癌基因等)(8)其它；多胺(PUT)、唾液酸(SA)等2)宿主反应标志物 血铁蛋白、2m、IL-2R、TNF、新喋呤等。3)不进入
18、循环体液的标志物：人乳脂肪球蛋白,检测的临床应用,1 诊断2 指导临床用药3 优化细胞毒素治疗,肿瘤标记物检测技术,肿瘤标记物的分子检测方法,肿瘤标记物的基因检测手段,1 免疫标记技术（RIA/EIA/FIA等）2 流式细胞术分析,肿瘤标记物的分子检测方法,检测的是肿瘤细胞表面的分子,肿瘤标记物基因检测手段,1 基因芯片 技术2 肿瘤蛋白质组学诊断,肿瘤临床分子检测的进展依赖于分子分析技术的进步。人类基因组序列和高通量分子分析技术的发展,使人们能够从DNA、RNA 和蛋白质水平上对肿瘤进行全面研究。,检测的是肿瘤基因、肽类、蛋白等,1 基因芯片 技术,原理 是根据遗传学中心法则，利用基因互补配
19、对原则，在同一载体上同时进行多基因检测。也就是把大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱判断样品中靶分子的数量。简单的说就是高密度的斑点杂交技术。,在肿瘤标记物检测中的用途 能分析一个肿瘤样本中的整个基因组,可能具有预见性价值。也能精确地检测现有的分子标记物。如雌激素受体和HER2,区分散发性乳腺癌和那些与BRCA 等位基因有关的病例。,基因诊断不能代替分子诊断的原因（1）绝大多数肿瘤不具遗传性。在绝大多数肿瘤中尚未发现肿瘤特异的基因突变。（2）与肿瘤相关的癌基因或抑癌基因的变异是后天获得的。基因组改变常常只限于肿瘤细胞,其它组织细胞甚至癌旁组织细胞基因
20、组DNA 没有相应的变异。故只能取肿瘤组织细胞而不能取外周血或其它组织细胞进行基因检测。（3）费用昂贵、操作复杂。,肿瘤标记物的一个新的研究新方向,在实体瘤患者的血清中检测肿瘤特异性DNA，将成为一种非侵入性肿瘤诊断新手段。基因改变的循环DNA作为一种候选标记物可用于早期发现肿瘤高危患者,甚至用于大批人群筛选。,2 肿瘤蛋白质组学技术,描述蛋白质及其翻译后修饰,显示不同疾病状态下蛋白的差异,研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA/RNA 的相互作用。蛋白质组学技术主要用于疾病相关蛋白质的分离和鉴定。二维凝胶电泳、质谱技术和生物信息学是最常见的三大技术。,肿瘤是基因性疾病,也可认为是一种蛋白质组疾病
21、。一个细胞由正常转变为肿瘤的过程中,细胞内蛋白质表达谱会发生一系列显著变化。找到相关的蛋白质标记物,就有希望实现肿瘤的早期诊断、早期治疗,并开发出靶向药物。肿瘤蛋白质组学是指对正常组织与疾病组织(从癌前病变到肿瘤)之间差异表达的蛋白质的鉴定和定量分析。,优势体现：(1)有多种不同表面性质的芯片可供选择。(2)样品需求量少。(0.5 400ml)(3)直接分析未经纯化的生物样品。如血浆、血清、尿液、脑脊液、痰液等;(4)灵敏度高。可以检出过去无法检出的大量低丰度、小分子量的蛋白质;(5)高通量。可以在数分钟内快速完成检测。,正常值 增高主要见于 也见于,CA 50 20U/ml 广谱肿瘤标记物
22、感染，自身免疫病CA125 35U/ml 卵巢癌 卵巢囊肿，子宫内膜异位CA15-3 28U/ml 乳腺癌 其他肿瘤CA19-9 37U/ml 胰腺癌 结/直肠癌、肝癌，胃癌CA242 12U/m 胰腺癌，胆管癌 非鳞癌比鳞癌高CA72-4 6U/ml 胃癌 结/直肠癌，肝癌，肺癌卵巢癌,部分肿瘤标记物,几种与P53相关的肿瘤标记物,cyclinD1：作为G1 期细胞周期相关蛋白,其基因和编码蛋白的异常以及与多种肿瘤相关基因的协同作用可促进细胞恶性转化。Survivin：是最近发现的一种凋亡抑制蛋白IAP 家族成员,其主要抑制caspase3、caspase7,阻断细胞的凋亡过程。体外试验表明
23、,survivin可在多种细胞中表达,并可见于几乎所有被研究的人类肿瘤组织中,而在正常成人的未分化组织中无表达。,COX-2：COX又称前列腺素环氧化酶还原酶。其基因COX-2 的过度表达可能通过其改变细胞某些与增殖及凋亡有关基因的表达而促进肿瘤生成。它调节肿瘤细胞增殖和凋亡的机制,可能通过其下游的各种前列腺素及血栓素结合于相应受体而发挥作用。bcl-2 是一个强有力的凋亡抑制因子,它的高表达使细胞凋亡明显减少,表达下降则表现为凋亡细胞增多。,p53基因 是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。有野生型和突变型两种。野生型p53是抑癌基因，能诱导细胞凋亡和促进分化;突变型p53是癌基因，可引起细胞恶性增殖且具有抗凋亡作用,导致细胞的转化和肿瘤的发生。由于体内外各种致癌因素的作用,p53基因发生缺失突变而导致肿瘤的发生。,谢谢！,
