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1、深圳市人民医院病理科分子实验室 姜阳阳2015-10-27,肿瘤分子检测方法与质量控制,医学发展历程的启示,经验医学,循证医学,精准医学,诊断靠治疗后期经验积累。,诊断治疗以人群、科学研究证据指导临床实践。,诊断治疗以个体为基础，更加提前、具体与精确。,分子时代,肺腺癌：EGFRKRASBRAFALK-ROS1RET等检测已是共识；肺鳞癌发生模式不同，检测靶标以扩增为主，同时EGFR、ALKROS1某些病例也有必要检测。,我们可以用的分子生物学手段：,实时荧光PCR方法（扩增阻碍突变系统法（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、PCR-高
2、分辨溶点曲线分析（HRM）、数字PCR等）PCR-杂交法（膜上、芯片基因芯片、乳胶颗粒Luminex）PCR-Sanger测序PCR-焦磷酸测序新一代高通量测序PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等荧光原位杂交（FISH）直接杂交免疫组化,分子病理检测的主要方法,检测技术,检测对象,检测基因,检测水平,EGFR，KRAS，BRAF，BRCA,BCR-ABL，JAK2,EML4-ALK，ROS1，HER2，RET,BRCA1，TOP2A，TYMS,EGFR，EML4-ALK，HER2,是RT-PCR平台上的特异扩增技术（易开展）共发表300多篇文献著名的大型临床研究-如IPASS、INFORM
3、等,国际肺癌协会专家共识中国基因突变检测专家共识日本临床专家共识,ARMS技术被临床证明的肿瘤基因突变检测技术,DNA 基因重排,融合mRNA或5/3 mRNA差异表达,嵌合蛋白表达,肺癌中ALK基因变异的表达调控,FISH/CISH NGS,RT-PCR 5/3比较qRT-PCRRACE-PCR,IHC,荧光原位杂交技术（FISH）,2个信号分离直径的要求，使实际应用中结果难以判断有5-11%出现假阳性信号分离1，2，3工作强度大，费时主观性强，受人为因素影响大,横向,纵向,1.FISH技术是美国药物临床试验中所采用的检测方法。2.采用“分离”分析，基因倒位和ALK重排后，红色和绿色探针分开
4、3.15%的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果1,操作简单，时间短结果客观，易于判读，减少人为因素的影响除FFPE样本外，还适用其他类型样本组织1与EGFR、RET、ROS1等其他检测不冲突，共用相同组织切片和PCR扩增程序，节约有限资源和时间中国荧光PCR仪器普及率更高，更加适合国情,实时逆转录法（Real Time-PCR）,CFDA批准的基因检测产品,基于Real Time-PCR方法检测驱动基因的分子诊断产品获得CFDA批准最多,2-3 片FFPE样品同时将DNA和RNA分离出来同时获得EGFR、ALK和ROS1检测结果,节约样本、节约时间、节约成本,DNA/RNA,EGF
5、R突变型,ALK阳性或ROS1阳性,EGFR野生型ALK阴性ROS1阴性,吉非替尼厄洛替尼埃克替尼阿法替尼,克唑替尼色瑞替尼,其他治疗方式,DNA/RNA共分离剂盒,EGFR/ALK+ROS1,2.5小时PCR,4.5小时,FFPE切片1-3片或活检小标本,2015 NSCLC NCCN指南,对于NSCLC患者建议检测EGFR和ALK基因状态；对于ROS1/MET/RET/BRAF/HER2等崭露头角的靶基因也给予关注,1.室内质量控制2.室间质量评价,分子病理实验室的质量控制,1.建立标准化的实验室2.具备资质且相对固定的人员3.性能稳定的试剂4.持续不断的学习和开展质控,医疗机构临床基因扩
6、增检验室管理办法（卫办医政发2010194号）医疗机构临床基因扩展检验实验室工作导则（卫办医政发2010194号）,FISH实验区,临床基因扩增实验室标准化操作文件（sop）,1.写你所做2.做你所写3.实验室的精髓,可操作性的sop文件,人员资质,理想的试剂,试剂方法的性能验证及每批试剂的质检性能指标：重复性（精密度）准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等）线性范围（定量）分析特异性 测定下限 抗干扰能力,资质认证试剂质量试剂反应性能前后批号结果一致性测定下限批内变异（10%)和批间变异（15-25%),你其实做了这些，但是你有记录么？,1.日常维护2.定期保养3.维修记录,实
7、验室最忠实的员工-仪器,全流程：标本接收-石蜡切片-核酸提纯-实时荧光定量PCR扩增-结果分析分析前：标本接收、制片、填写检测申请单分析中：核酸提取、扩增、产物分析、检测有效性判断分析后：结果分析、报告审核、结果解释标准：重复，可控，规范,全流程室内质控,DNA模板质量更重要，建议对提取的DNA模板进行质量检测：OD260/OD280=1.80.2，OD260/OD2301.7,全流程室内质控,积极参加各级室间质量评价,1.深圳市病理质控中心2.广东省临床病理质控中心3.卫生部临床检验中心4.有条件可参加更多检测机构（PQCC、EMQN、CAP等）,Thank You!,敬请各位专家提出宝贵意见,
