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1、临床微生物标本的采集及病原菌耐药检测,泰安市中心医院检验科 姜梅杰,1.标本留取以及运送应该注意什么呢?2.病原菌耐药检测该注意什么呢?,内 容,病原菌耐药检测及监测,微生物标本采集的基本原则,1.及时采集微生物标本作病原学检查2.在抗菌药物使用前采集标本3.采样时严格执行无菌操作4.采样后立即送检5.棉拭子标本宜用运送培养基6.混有正常菌群标本，不可置肉汤培养7.标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂。8.送检标本应注明来源和检验目的,如何提高细菌阳性检出率？,标本采集时机标本采集方法标本的质与量标本的运送与保存镜检筛选合格标本（退检制度）高质量、多种分离培养基培养环境,血培养标本,对怀疑菌血
2、症、真菌血症的患者，在考虑使用抗菌药物之前，应立即采集血培养标本。必须同时或间隔短时间内采集套以上血培养标本。,血培养的采集时间,成年患者：推荐同时采集套（不同部位）血培养标本（即双瓶双臂同时采集血培养标本）。婴幼儿患者：推荐同时采集次（不同部位）血培养标本。,血培养的采集次数,血培养做1套的检出率为65%。做2套和3套检出率的检出率分别为80%和90%。单瓶的血培养检出率不高，而且结果很难临床解释。在采取血培养后的2至5天内，无需重复采取血培养。两个例外：细菌性心内膜炎和金黄色葡萄球菌菌血症。,血培养的采血量,成年患者：推荐采血量每瓶不少于5ml。婴幼儿患者：推荐采血量每瓶不少于2ml。（少
3、于病人总血容量的1%）,血标本采集的量是影响检出率的最重要的因素。检出率与采血量成比例增长，每增加1ml的血液，病原菌的检出率就会相应增加。儿童患者因为血液中病原菌浓度较高，血培养量无需等同于成人。采用一对（需氧瓶+厌氧瓶）组合，比采用二个需氧瓶的组合可检出更多的葡萄球菌、肠杆菌科细菌和厌氧菌。采血量不能满足推荐的采血量时，应首先满足需氧瓶的需要。,推荐使用碘町、洗必泰或碘伏作为皮肤消毒剂。碘町作用1min碘伏作用1.5-2min洗必泰作用时间与碘町一样（但不能用于少于2个月婴儿皮肤消毒）,血标本采集的注意事项皮肤消毒,推荐从外周静脉采集血液标本。不推荐动脉血，因其诊断价值没有比静脉血更大。不
4、推荐静脉留置导管，因其常伴有高污染率。如果必须从留置导管内采血，也应同时从外周静脉采集另外一个血培养标本以帮助阳性结果的判读提供解释。,血标本采集的注意事项采集部位,在采血之前，血培养瓶的橡皮塞需使用70%酒精消毒并干燥。然后再进行穿刺部位的皮肤消毒。严格按照“酒精、含碘消毒剂、酒精”的消毒步骤操作，并等待足够的消毒时间。严格无菌操作，不允许在皮肤消毒后用手接触静脉，除非带有无菌手套。不推荐采血和接种血培养瓶更换注射器针头。,血标本采集的注意事项采集方法,采集后的血培养瓶应在1小时之内送往实验室。血培养瓶在采血接种后在室温不超过数小时。血培养瓶在接种前和接种后均不得冷藏或冷冻。,血标本采集的注
5、意事项标本的运送,痰培养标本,采集与运送,病原体种类繁多而复杂,使下呼吸道感染病原诊断成为难题,细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）真菌（包括肺孢子菌）病毒支原体、衣原体与立克次体原虫寄生虫,咳痰途经口咽部,唾液中口咽部定植菌的浓度可达108-109/ml。研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。,不可避免地受到污染,咳痰标本的采集,标本采集方法 医师或护士直视下采集标本。病人先漱口，去除表面的菌群。教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液。,关于咳痰标本,在抗生素应用前采集痰标本;标本采集后12h内必须立即进行实验室处理；咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本;取标
6、本前应摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口;深咳，采集标本过程中要有专业的医务人员指导;无痰可用35NaCl 5ml雾吸约5min导痰；也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰；,咳痰标本不合格，退检吗？,如果低倍视野下鳞状上皮细胞大于25个，白细胞小于10个，应不做或仅在特殊要求时做培养。如做培养，报告中注明“镜检结果表明标本口咽分泌物污染明显”。,痰培养的送检次数,对于普通细菌性肺炎，痰标本送检每天1次，连续23天。不建议24h内多次采集，除非痰液外观性状出现改变；怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检；,痰培养,方法的局限性：多数引起肺炎的病原菌不能培养，如病毒，军团菌，衣原体等
7、影响因素很多：如黏液包裹、定植菌污染建议：细菌培养同时做血培养和痰涂片镜检,痰培养的运送和保存,尽快（2h）送至实验室。如不能及时送达，应将标本暂存于4，但放置时间不可超过24h。厌氧培养标本的最佳运送时间取决于标本量。被口咽部菌群污染的标本如咳痰等不可用于厌氧菌培养。,尿培养标本,采集与运送,尿培养,诊断症状明显的病人（如尿急、尿频、尿痛），一份标本就已足够，治疗48-72小时后再采集第二份标本。对于症状不明显的病人，需采集2-3份标本。怀疑肾结核时，应连续3天采集晨尿。多次收集或24小时尿不能用作培养。申请单上必须注明病人症状是否明显，这对于定量培养分析非常重要。室温都有利于病原菌和污染菌
8、会生长繁殖，因此若30min内不能及时培养尿液则必须冷藏，但也不能超过24小时。,清洁中段尿液,尽量取早晨第一次尿液弃去开始流出的尿液，以冲刷尿道口的细菌，取能代表膀胱部位病原菌的中段尿详细告知病人以下操作步骤女性病人收集标本前用清洗液冲洗干净，从前向后仔细擦洗尿道区域分开阴唇，开始排尿排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人回缩包皮并清洗龟头排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿,导尿管尿液,集尿袋内的尿液不能用作培养。导尿管末端的尿液也不能用于培养，因为很难避免没有尿道菌群污染。留置导管尿液标本常通过专门的采样端口采集，不能把导尿管与尿袋拔开后收集尿液。采样端口用酒精消毒；必要时，可先夹
9、住导尿管但不能超过30分钟；将注射器针头插入采样端口，抽吸出尿液；注入无菌杯或试管中。,脑脊液标本,采集与运送,脑脊液标本的运送,常温立即送检，实验室收到标本后应立即接种。脑脊液标本送检的理想时间为15分钟内，半小时送检是可接受的，如果送检时间超过1小时，则会影响结果，在结果报告时，在备注处注明此情况。如不能及时送检，可使用血培养瓶（怀疑脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌感染时，请勿使用血培养瓶）。,手术切口与软组织感染标本,采集与运送,皮肤组织标本,对大多数开放脓肿、伤口，采集前应先去除表面菌群。干燥、结痂伤口一般不做培养。闭合脓肿应取渗出物和脓肿壁标本。代表性的标本应采自病灶活动区域或基底部,而不仅
10、仅是脓液。,病原菌耐药检测及监测,葡萄球菌的耐药问题及检测,青霉素耐药、诱导性-内酰胺酶检测 MRSA/MRCoNS的问题,葡萄球菌诱导性-内酰胺酶检测,MRSA/MRCoNS检测,ESBL AmpC KPC NDM-1,肠杆菌科的耐药问题及检测,ESBLs 检测方法,头孢他啶/棒酸,ESBLs阳性：酶的抑制剂复合药物比单药抑菌圈5mm注意 ESBLs和Ampc酶同时产生时，CLSI的无法对ESBLs判读,质粒介导的AmpC酶,部分大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌初筛试验疑似 产ESBL，但确认试验阴性（酶抑制剂不能抑制）。对头霉素耐药，头孢吡肟敏感。对碳青霉烯敏感。,KPC碳青霉烯酶检测方法（改良H
11、odge试验）,阳性：测试菌株划线与抑菌圈边缘交叉部分出现扩大的长菌区阴性：测试菌株划线与抑菌圈边缘交叉部分无扩大的长菌区,金属酶NDM-1的检测,检测结果的解释,不可能的药敏结果,金葡菌青霉素S，苯唑西林R，头孢西丁R肠球菌万古S，替考拉宁R肠杆菌属头孢噻吩SG球菌多数氨基甙类S，庆大R李斯特菌 青霉素R，头孢菌素S肠杆菌科菌 对一、二代头孢菌素S，对三、四代头孢 菌素R,血培养为金黄色葡萄球菌,药敏试验结果正确么？敏感头孢唑啉，万古霉素，利奈唑烷，红霉素耐药苯唑西林，林可霉素，青霉素，庆大霉素,药敏试验预测表,MRSA/MRCoNS对所有-内酰胺类抗生素耐药ESBL菌株对所有青霉素和头孢菌
12、素耐药高水平耐庆大霉素的肠球菌对阿米卡星、妥布霉素耐药非-内酰胺酶介导的耐氨苄西林的肠球菌对所有青霉素类耐药,耐药性的特殊分布,耐万古霉素的葡萄球菌耐亚胺培南的肠杆菌科细菌耐青霉素的A/B群链球菌耐青霉素的肺炎链球菌（脑脊液分离出的标本）耐万古霉素的肠球菌,药敏试验敏感的药物，为什么临床治疗无效？,病例报道-猪霍乱沙门氏菌引起的败血症,患者，男，23岁，因发热3d，于2010年1月入院治疗。体格检查：体温38.8，脉搏96/min，呼吸20次/min，血压110/70 mmHg，神智清，精神差，全身皮肤粘膜黄染，双肾后扣痛。患者自述头痛，自觉尿少，食欲下降，伴有恶心、呕吐；无咳嗽、无腹痛、腹泻
13、。B超显示 脾下有约10.18.5cm的囊性包块。血常规：白细胞4.42109/L，分类 中性粒细胞0.93，淋巴细胞0.05，单核细胞0.02，血小板59109/L。血生化：谷草转氨酶125U/L，血清尿素10.32mmol/L，肌酐133 mmol/L，总胆红素131.6，直接胆红素86.8。尿常规检查：尿蛋白阳性（3+）。临床初步诊断：败血症，中毒性肝炎。(来自不同部位沙门氏菌如血液和肠道的药敏结果的报告）,临床治疗,为有效控制感染，临床医师依据经验首先选用奥硝唑和氟罗沙星治疗2d效果不佳，后根据药敏用头孢哌酮/舒巴坦治疗，同时采用腹腔脓肿穿刺引流术引流脓液，患者体温恢复正常范围。15d
14、后患者各项检查均恢复正常，感染得到有效控制。注：体外沙门氏菌感染，必须检测奈啶酸的药敏结果,导管相关性的血流感染诊断方法,若两套阳性血培养是同一菌（依细菌鉴定和药敏谱确认）又没有任何其它部位感染的证据，提示为CRBSI。2.若两套阳性血培养是同一菌从导管采血血培养报阳性的时间比上一套早120分钟若没有任何其它部位感染的证据，提示为CRBSI,导管相关性的血流感染诊断方法,若两套阳性血培养是阴性只有导管采血的血培养是阳性，不能定为CRBSI。提示可能是导管的定植菌或采血过程中污染所致。,导管相关性的血流感染诊断方法,1.若只有外周血的血培养是阳性但分离菌为金葡菌或念珠菌且没有任何其它部位感染的证
15、据，提示高度可疑CRBSI。2.实验室若要报告CRBSI，要求导管片段的半定量或定量培养。若为同一菌、或没有任何其它部位感染的证据情况下，再次外周血采血，培养阳性，且是同一株菌。定为CRBSI,前十位细菌种类分布百分率（%）,细菌培养的意义,培养阳性感染排除污染排除定植任何结果都必须结合临床症状及其它相关检查进行综合分析,培养阴性排除感染标本采集部位和方法是否在使用抗生素时留取的标本？标本运送时间和方法是否正确标本接种、培养基及培养方法的选择是否正确是否可能是厌氧菌或其它难培养的细菌感染,细菌培养的意义,微生物与药师的意见是十分有参考意义的。但致病原检测结果的意义应由临床医生来作出最终判断。我们会不断的改进工作以满足临床需求,小 结,谢 谢！,
