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1、临床细菌检验标本的处理,临床细菌检验标本的采集、运送、保存和处理,1、所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染原则下认真进行。2、已采集标本都应置于防漏、密闭的容器中运送。已采集标本，常规性细菌学检验，不超过1h送实验室。保存在4也不能超过24hr。3、每份标本都应标记患者姓名、化验单联号、标本来源、检验目的、日期及相关临床信息。收到标本认真查对，看标本留取是否合格。,4、避免来自寄生菌的污染，应当保证每份标本代表感染过程。如来自皮肤、呼吸道的正常菌丛过早、过度生长，会干扰培养结果。分离时应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。5、分离细菌的目的：查找与疾病相关的微生物及其对抗生素的敏
2、感性，帮助临床诊断、治疗、预后和流行病学的调查。6、如疑似对低温敏感的淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌感染标本应立即处理。脑脊液、生殖道、眼睛、内耳标本决不可冷藏。7、根据标本来源选用培养基及孵育环境。,血液、骨髓标本的处理,了解血培养仪所用培养基的种类：需氧（成人、儿童）、厌氧、真菌培养基。标本用量：采血量：成人8-10ml，儿童1-3ml；骨髓用量：1-3ml；真菌：1-5ml；厌氧菌：3-10ml。培养仪上阳性报警标本要及时处理：消警、登记报警时间、用注射器抽取培养液接种平板，血平板分离各类细菌特别-溶血链球菌，肺炎链球菌；巧克力平板于CO2环境分离嗜血杆菌、奈瑟菌。真菌培养接种两
3、个TTC-沙氏平板，分别放室温22及35孵育24-48hr。均需分区划线。,然后涂片革兰染色镜检，把镜检结果及时电话通知主管医师，并填写初检结果临床通知单。例如：检到葡萄状排列G+C,可报告“找到G+C，形似葡萄球菌”。常规培养5天，认为阴性者，报告无菌生长正常人的血液、骨髓是无菌的，标本中检出细菌，都应视作病原菌 需排除污染。,脑脊液标本的处理,涂片查抗酸杆菌：脑脊液以4000r/min离心30min，取沉淀物涂片，做抗酸染色。涂片查新型隐球菌：将脑脊液离心沉淀物进行墨汁染色，在黑色背景中见到菌体周围有透明荚膜，有时可见出芽的酵母菌。脑脊液培养用血培养仪，阳性报警标本处理同血培养。注意：涂片
4、检到平面相对、成双排列GC,可报告“找到GC,形似脑膜炎奈瑟菌”。巧克力平板于CO2环境分离脑膜炎奈瑟菌和嗜血杆菌。,尿标本的采集运送和处理,中段尿采集：清洁外阴及尿道口周围，自然排尿，让尿流不间停，截留中段尿不少于1ml。2hr内送交实验室，在4C也不能超过24hr。实验室接到标本应立即处理。细菌培养接种血平板和麦康凯，真菌培养选用TTC-沙保罗平板。尿定量培养：用10ul定量接种环取尿液标本划线于血平板上呈一条直线，不要划到底，然后沿直线左右划线，从上而下一次完成，不可来回划线和分区划线。置35培养18-24hr，生长菌落数乘以100，可求出每毫升生长菌落数。,涂片查细菌、真菌：尿液以30
5、00r/min离心30min，取沉淀物涂片革兰染色镜检。涂片查抗酸杆菌：尿液以4000r/min离心30min，取沉淀物涂片抗酸染色镜检。注意：10%的尿路感染患者，可能会在同份尿标本中分离到2种细菌，并都是病原菌。若同份标本中检到3种以上不同种微生物，应认为收集或处理标本不当被污染，一般认为：尿标本中革兰阴性杆菌菌落计数105 CFU/ml、革兰阳性球菌计数104CFU/ml有诊断意义，报告鉴定结果及药敏试验。,痰标本的处理,痰应用冷开水漱口咳痰，2hr内送实验室。培养前的处理：向痰液内加等量的胰酶溶液，放置35 30min使痰均质化。然后挑选痰液中脓性或带血部分涂片直接镜检看白细胞和上皮细
6、胞及真菌，待干后革兰染色检查细菌和真菌。标本信息及镜检结果都要登记。痰涂片目的有二：其一为确定标本是否适合做细菌培养。符合要求的痰标本应在低倍视野中白细胞25个，上皮细胞10个。其二是初步判定是否有病原菌存在。,痰直接涂片查细菌、真菌：挑选痰液中脓性或带血部分，涂成均匀薄片，进行革兰染色，镜检。痰涂片查抗酸杆菌：把痰前处理液加入痰标本中，两者比例约2：1，混合均匀，放室温静置10-20min，待粘液完全液化，倒试管离心3000r/min5-10min，取沉淀物涂片抗酸染色镜检。培养基选择：血平板分离各类细菌特别溶血链球菌，肺炎链球菌。加万古巧克力于CO2环境分离嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌。麦康凯分
7、离革兰阴性杆菌。真菌培养接种两个TTC-沙氏平板，分别放室温22及35孵育24-48hr。均需分区划线。,粪便标本的处理,涂片检查：当检查霍乱弧菌以及菌群失调优势菌时需作直接涂片检查。取新鲜标本涂片革兰染色镜检：观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌各种菌在涂片中所占相对比例、推断主要优势菌有革兰阳性芽生孢子和假菌丝即报告检出酵母样菌。真菌也可湿片检查。一般培养：直接挑取标本中脓血部分接种SS平板和血平板严格按照三区划线，保证有单个菌落的分离，置35培养。,真菌培养：将标本接种两个TTC-沙氏平板及血平板，置25-30和35孵育24-48hr。真菌性腹泻多继发于抗生素治疗后，常见有白色假丝酵母菌。对
8、化验单上明确要求做霍乱弧菌培养以及霍乱弧菌快检阳性的均应做霍乱弧菌培养，以便确诊和做进一步分型。方法是取一环大便标本或碱性蛋白胨水增菌液接种碱性平板或TCBS平板及血平板，要求三区划线，然后置35孵箱中孵育。,眼耳鼻喉拭子标本的处理,根据这些部位感染细菌的特点，须用血平板和巧克力平板作分离培养，必要时加选麦康凯，需分区划线。巧克力平板在CO2 环境中孵育，利于肺炎链球菌、嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌的生长。涂片检查：将拭子直接在玻片上涂片，革兰染色镜检查细菌、真菌，如果查真菌还可以湿片直接在高倍镜下检查芽生孢子和假菌丝。正常人的眼内,中耳及鼻窦内是无菌的。,脓液标本的处理（病灶分泌物）,1、涂片检查
9、：脓液标本在培养的同时均须涂片，涂片的结果一方面为临床提供最初的诊治依据，另一方面可作为分离培养的质量指标。2、涂片直接做革兰染色，镜下可观察细菌和酵母样菌。涂片做抗酸染色镜检查抗酸杆菌。3、淋病奈瑟菌涂片，注意细菌形态是否典型，革兰阴性球菌，平面相对、成双排列分布在细胞内或外。,4、培养：血琼脂平板和麦康凯琼脂平板是基础的分离培养基，另外应接种巧克力平板，置CO2环境中孵育，可分离嗜血杆菌和奈瑟菌。以分区划线法接种。注意：对无菌部位的感染，从分泌物中分离到细菌，一般均有临床意义。烧伤创面脓液或分泌物中，以铜绿假单胞菌最多见，次为金黄色葡萄球菌，再次为变形杆菌，而大肠埃希菌、肺炎克雷伯、粪产碱
10、杆菌及白色念珠菌感染亦不少见。,无菌体液标本的处理,1、无菌体液是指血液骨髓和脑脊液外的羊膜液、后穹隆穿刺液、透析液、心包液、腹膜穿刺液和滑膜液。2、涂片检查：这类标本因原部位是无菌的，只要检出细菌即可做出诊断。所以，直接涂片很重要。3、标本如为浆液，可先经3000r/min离心，取沉淀涂片。如为脓液，可直接涂片。涂片固定后，作革兰染色和抗酸染色。,4、胸水和腹水的涂片在观察时应予注意是单一菌种，还是混合菌感染。因为胸腔和腹腔内器官的感染往往是混合菌引起的。胸水涂片中如见到梭形革兰阴性杆菌，说明有厌氧菌的感染可能，在报告中应表示出来。5、涂片做抗酸染色很重要，不少感染有结核性的，另外奴卡菌和放
11、线菌是部分抗酸性的，作抗酸染色也有利于发现这类细菌的存在。,6、培养：无菌体液含细菌数量较少，必须做增菌培养。一般注入培养瓶上血培养仪，标本处理如血液。如果标本量太少接种完平板后，可用自配葡萄糖管增菌。7、培养基的选择：接种血平板，分离一般细菌，巧克力平板置CO2环境中以分离嗜血杆菌，麦康凯琼脂分离革兰阴性杆菌。如果真菌培养接种TTC-沙氏平板。需分区划线接种。,生殖系统标本的处理,1、淋病奈瑟菌涂片检查：将拭子直接在玻片上涂片，革兰染色镜检，如看到白细胞内有革兰阴性双球菌，呈双肾形，即可根据形态作出初步报告。2、如果查真菌可以用生理盐水制湿片直接镜检看芽生孢子和假菌丝，也可以革兰染色镜检。3
12、、查抗酸杆菌可直接涂片做抗酸染色镜检。,4、细菌培养：接种血平板，分离一般细菌，麦康凯琼脂平板分离革兰阴性杆菌，巧克力平板放5%-10%CO2环境中可分离淋病奈瑟菌。以分区划线法接种，置35孵育。5、真菌培养：将标本接种两个TTC-沙氏平板及血平板，分别放室温22及35孵育24-48hr。,医院感染环境监测标本的处理,各类环境空气、物体表面、医护人员手培养菌落总数卫生标准,空气中微生物的采集与检测,采样时间：选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。采样高度：与地面垂直高度80-150cm。布点方法：室内面积30m2，设一条对角线上取3点，即中心一点、两端各距墙1m处各取一点；室内面积30m2
13、，设东、西、南、北、中5点，其中东、西、南、北点均距墙1m。采样方法：用7cm直径的普通营养琼脂平板在采样点暴露10分，或用9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5min。,标本处理：收到平板后立即放35 孵育24hr。结果判断：根据奥氏公式：C(cfu/m)=50000NAT N-菌落数 cfu/平板，A-平板面积 cm2，T-平板暴露时间 min。如果使用7cm直径的平板，暴露10min，则C=130N。,医疗器械灭菌效果的检测,采样时间：在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。注射器的检测：以无菌操作方法取注射器吸5ml无菌葡萄糖管液抽吸几次后，将葡萄糖管液再打进试管，然后置35孵育24h
14、r后取出，取一环接种血平板，再放35孵育24hr后无菌生长为合格。,输液器的监测：以无菌操作将5ml无菌葡萄糖管液注入输液器中，使葡萄糖管液再流进试管，置35孵育24hr后取出，取一环接种血平板，再放35孵育24hr后无菌生长为合格。小件医疗器械的检测：将缝合针、手术刀片等直接放入5ml无菌葡萄糖管，充分混匀后然后置35孵育24hr后取出，取一环接种血平板，再放35孵育24hr后无菌生长为合格。,物体表面采样检测,采样时间：选择消毒处理后4h内进行采样。采样面积：被采表面100cm2,取全部表面；被采表面100cm2,取100cm2。采样方法：用55cm的标准灭菌规格板,放在被检物体表面,用浸
15、有无菌生理盐水的棉拭子在规格板内横竖往返各涂抹10次,剪去手接触部分,将棉拭子放入装2ml无菌生理盐水的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。,标本处理：收到标本后应充分混匀，取20ul液体接种血平板，用接种环像接种尿标本一样划线，然后置35 孵育24hr。判断标准：、类区域：细菌总数5cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。类区域细菌：总数10cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。类区域细菌：总数15cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。母婴同室、早产儿室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的物体表面不得检出沙门菌。,医护人员手培养,采样时间：在接触病人和从事医疗
16、活动前采样或消毒后立即采样。采样面积及方法：被检人五指并拢，将浸有无菌生理盐水采样液的棉试子在手的每个掌面从指根到指端来回涂擦10次后，并随之转动采样棉试子，剪去手接触部位，将棉试子放入装有2ml无菌生理盐水的试管内送检。标本处理：收到标本后应充分混匀，取20ul液体接种血平板，用接种环像接种尿标本一样划线，然后置35 孵育24hr。,判断标准：、类区域工作人员：细菌总数5cfu/cm2，并未检出金葡、大肠、铜绿为消毒合格。类区域工作人员：细菌总数10cfu/cm2，并未检出金葡、大肠为消毒合格。类区域工作人员：细菌总数15cfu/cm2，并未检出金葡、大肠为消毒合格。母婴同室、婴儿室、新生儿
17、室及儿科病房的工作人员手上，不得检出沙门氏菌、大肠埃希菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌为消毒合格。,消毒液染菌量的监测,采样时间：采取更换前使用中的消毒液与无菌器械保存液。采样量及方法：在无菌条件下，用无菌吸管吸取1毫升被检液，加入9毫升稀释液中混匀送检。不同的消毒剂加入相应的中和剂，对于醇类与酚类消毒液，稀释液用普通营养肉汤即可，对于含氯消毒液、含碘消毒液、过氧化物消毒液，需在肉汤中加入中和剂0.1%硫代硫酸钠；对于醛类消毒液，需在肉汤中加入0.3%甘氨酸。标本处理：收到标本后应充分混匀，取200ul液体接种血平板，用接种环像接种尿标本一样划线，然后置35 孵育三天。,结果分析：若每个平板菌落数在10个以下,仍可用于消毒处理(但不能用于灭菌),若每个平板菌落数超过10个,说明每毫升被检样液含菌量已超过100个,即不宜再用。注意事项：不同消毒剂使用不同的中和剂中和。采集消毒液样品时应在消毒液内没有物品或防入物品消毒作用到规定时间之后进行采样。使用中消毒液每季度监测一次，细菌菌落总数应100cfu/ml,不得检出致病微生物。使用中灭菌剂每月监测一次，应无菌生长。无菌器械保存液必须无菌生长。,
