临床基因扩增检验质量保证.ppt

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1、临床基因扩增检验的质量保证,卫生部临床检验中心 李金明,质量保证(Quality Assurance,QA),为一产品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。,室内质量控制（Internal Quality Control,IQC)的概念,由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。可概括为:(1)执行者：实验室技术人员；(2)目的：监测实验室测定的重复性；(3)功能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对

2、实验室测定的即时性评价。,室间质量评价（External Quality Assessment,EQA）,为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定在实时的测定结果的可接受性。当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实验室能力验证（Proficiency testing,PT）。在以前的文献中，EQA常描述室间质量控制。,批(Run),在相同条件下所获得的一组测定。,定 义,正态分布(Gaussian

3、distribution)当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，当测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。,正态分布的基本统计学含义可用均数（X）、标准差（s）和概率来说明。,临床基因扩增检验实验室常规测定步骤,标本收集：选择测定项目、标本收集和保存。实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价值。报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。,质量保证、室内质控和室间质评之间的关系,临床标本收集、运送、保存及其质

4、量控制,标本收集 标本保存标本运送,标本收集,标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 标本的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染,标本采集时间对扩增检测结果的影响,在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。,标本采集部位的准备,血液标本采集分泌物标本:采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其它杂物,但应适度,过度清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微生物,故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。,标本的类型和采集量,标本的类型:血清(浆)、分泌物、痰、粪便、尿和脑脊液等。标本的采集量:应根据所测病原体而定。一般来说，如果标本的量对病原体培

5、养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。对于定量测定来说，对标本的收集要求更为精确。,采样质量的评价,血清(浆)标本:溶血、脂血等；分泌物、痰：评价内容包括细胞组成，所需类型细胞的数量和核酸总量。评价方法：包括肉眼观察,显微镜下观察和化学分析等。,采样及运输容器,标本的采集材料如棉签应为一次性使用；采样及运输容器应为密闭的一次性无菌装置；采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。,标本采集中的防污染,采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等；如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，以使可能存在的RNase失活。,标本保存,靶核酸(尤其是R

6、NA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要。使用GITC作为稳定剂保存标本，标本可在室温下稳定约7天。,标本保存,临床体液标本长期保存应在-70下。如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)缓冲液中4 下保存。用于RNA扩增分析的样本，则应于上述缓冲液中-80或液氮下保存。核酸的乙醇沉淀物则可于-20下保存。,标本运送,样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下

7、运送或邮寄。实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。,临床基因扩增检验的室内质量控制,测定前的质量控制核酸样本的制备及其质量控制 统计学质量控制质量控制的评价,测定前质量控制,实验室设施、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法 人员培训,实验室设施、仪器设备及管理,临床基因扩增检验实验室应有充分合理的空间、良好的照明和空调设备；实验室仪器设备应保养良好，实验用品要达到相应的要求。加样器的校准？带滤塞吸头的使用及质检？离心机？热循环仪？水浴箱和/或恒温干浴仪？酶标仪和洗板机？,理想的核酸扩增实验室设计A,理想的核酸扩增实验室设计B,核酸扩增检测实验室设计的一般原则,各区

8、独立注意风向因地制宜方便工作,“十六字口诀”,A,B,传递窗,传递窗,传递窗,“无基因”或“无核酸”概念的重要性,基因扩增仪器设备的质控,带滤芯吸头的使用及质检,首先制备一个含12%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸头的最大体积为100l，则将加样器吸取体积调至110120l，再套上吸头后吸取上述有色液体。如果吸头质量好，则有色液体不应出现在滤芯之上，否则说明滤芯不严。,核酸提取用离心管质检,离心管PCR抑制物质检其他,扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法,一是使用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示记录仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统，当孔间温度变异超出1时，其可测出来。具体做

9、法是将装有TE缓冲液并上加石蜡油的扩增反应管放置于扩增仪各孔中，热电偶探针透过扩增反应管盖插至缓冲液中，然后按程序进行一个常规的PCR扩增，加热模块如为96孔，则至少要测定12孔不同位置孔内的温度，在整个扩增过程中，可移动热电偶探针至上述不同孔中监测温度，但每一孔内温度监测至少要有一个扩增周期。,扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法,第二种方法并非直接测定孔内温度，而是通过扩增功能来间接获知孔间的均一性，即将加有一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测，观察结果的一致性程度，如果有某一个或几个孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性

10、结果，如果是，则表明相应孔的热传导有损坏。,理想的试剂和操作方法,试剂盒的质检定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平方根(SD)=上式中SDa、SDb、SDc是步骤a、b、c等（例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等）的标准差,理想的试剂和操作方法,改善测定精密度的措施必须首先着重在最不精密的步骤上，应对试剂准备、标本收集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”(SOP),实验室质量管理体系的建立,质量手册质量体系程序文件标准操作程序(SOP)(相关记录表格、报告),存在问题,SOP：形式，缺乏可操作性记录：检查型。多而杂。质控：形式或没有分析：缺乏。,实验室质量管理

11、的内涵,写你所应做的做你所写的记录你已做的分析你已做的,看得见的看不见的,好习惯是生产力习惯即命运思维习惯与行为习惯罗马不是一天建成的(Rome was not built in a day),质量体系文件的三大特性,法规性、唯一性和适用性。法规性:是指文件一旦制定完成并批准实施，就必须认真执行，按照相应的文件去完成日常检验工作，也就是前面所说的做你所写的。并且文件的修改不能随意，只能按规定的程序进行。唯一性:则是指（1）一个实验室只能有一个质量体系文件系统；（2）一项检验活动只能有唯一的操作程序；（3）一项规定只能有唯一的理解，不产生歧义；（4）只能使用文件的有效版本，无效版本在实验室的任何

12、地方都不能使用。适用性:是指质量体系文件无统一格式；无标准文本；怎么做怎么写，切合实际，具有可操作性，不拘一格。所有文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到。当发现文件有不适合情况时，则应立即按规定程序对文件进行修改。,SOP等于试剂盒说明书吗？,怎样编写SOP？,SOP（5W和1H）,谁来做(Who)：责任人做什么(What)：适用范围何时（When）：适用范围何地（Where）：适用范围为什么做（Why）：目的如何做（How）：操作步骤,实验记录表格的设计,存在问题,表格种类繁多重复记录表格无实用性，用于检查的痕迹很重,记录表格设计的基本原则,信息充分简单明了临床标本的检测信息能有

13、机联系起来融入LIS系统？,临床PCR检验流程记录表 检验日期 检验项目：扩增仪中保存文件名：使用说明：1本记录表须严格遵循试剂准备区标本制备区扩增区（产物分析区）单一流向移动，严禁逆向移动。2各项工作执行后，在相应叙述前的“”内打“”。3本记录表最后与相应的标本接收记录等归档保存于扩增区的专用文件柜内，以备查找。,实验前准备 试剂在有效期内 扩增仪、加样器和温度计在校准的有效期内 生物安全柜的滤膜在使用有效期内 消毒溶液在有效期内 洗眼器内无菌生理盐水在有效期内 离心管、带滤芯吸头已经过质检合格 操作者：,试剂准备区（1区）实验前：打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）冰箱温度：冷

14、藏室（28）；冷冻室（182）实验室温度：（允许范围：1030）；相对湿度：（允许范围：30%80%）PCR试剂来源：（可直接列出有关厂家名称）批号：XXXXXXX 检验项目：本次实验用量：人份，剩余量：人份。其他有关试剂配制：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制1%含氯消毒液 毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制4NaOH溶液 毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯 毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制 毫升；其他：仪器设备使用：离心机：正常 不正常 振荡器：正常 不正常 超净台：正常 不正常实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）

15、SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外照射30分钟以上。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：,标本制备区（2区）实验前：打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）冰箱（柜）温度：冷藏室（28）；冷冻室（182）实验室温度：（允许范围：1030）；相对湿度：（允许范围：30%70%）阳性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置：阴性室内质控物来源：批号：扩增位置：所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：191725 334149 2101826 3442503111927 3543514122028 3644525132129 374553

16、6142230 3846 5471523313947 5581624324048 56核酸提取及加样过程：按XXX（列出编号）SOP进行。仪器设备使用：生物安全柜：正常 不正常 恒温仪温度校准：离心机：正常 不正常 振荡器：正常 不正常实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：,另外两个存在较多问题的档案记录,人员的技术档案：一人一个档案（包括个人基本情况；学历、学位、任职资格、培训证、上岗证、荣誉证书等的复印件；论文、著作、成果等的目录和必要的证明文件复印件；培训考核的记录等。）仪器设备的技术档

17、案：一台仪器一个档案（包括仪器基本情况，如仪器设备名称、型号、序列号、生产厂家、购置日期、启用日期、目前放置地点、责任人等；仪器校准的记录（本次校准日期和下次应校准的日期、校准证书或数据）；维修维护的历史记录；仪器使用说明书、注册证等的复印件；合格证书；配备的小配件如保险丝、灯泡等）,人员培训,方法原理核酸扩增检测的关键环节仪器设备使用、维护和校准结果的分析、报告及进一步处理质控的分析知其然又知其所以然。,实验室人员内部培训的重要性,外部培训提供的是“理念”，是被动的，更多的是“学习”内部培训是主动的，源于实践，高于实践，更多的是“思考”,人员培训,如何培训的举例：新购仪器设备的操作培训,在仪

18、器购买合同中，加入培训的内容：厂家提供培训计划培训计划应包括：培训教材（含具体培训内容，如仪器操作及维护校准的SOP、安全性）、培训者资质证明、培训所需时间与次数、需要接受培训方准备的条件（人员、用具和场地等）、培训合格的考核方法及判断标准等。培训后保存所有有关记录。,核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制,一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理核酸的分离纯化靶核酸提取的质量 临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 核酸样本制备及扩增检测的质控 产物检测的质控,核酸的分离纯化,核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。经典方法硅吸附法对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室

19、在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。,临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质,临床标本中：血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。,对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施,质控措施：采用内质控（internal control,IC）（通常称为内标）的方法 内标有两种,即竞争性的和非竞争性的内标。,核酸提取及扩增有效性的质控,已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，

20、其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测的有效性的综合反映。已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染。,室内质控方法,非统计学方法统计质控方法,非统计学方法,在检测血液标本的同时，检测一定数量（与临床样本的数量相适应）的已知弱阳性（与试剂宣称的测定下限相适应）和阴性的质控样本检测有效的质控判断方法：阳性检测为阳性（反应性），阴性检测为阴性（非反应性）。,统计学质量控制,理想的室内质控样本的条件测定中质控样本的设置、数量及排列顺序 统计学质控的特点 统计质控方法,理想的室内质控样本的条件,基质与待测样本一致；所含待测物浓度接近试验的决定

21、性水平；稳定；靶值或预期结果已定；无已知的生物传染危险性；单批可大量获得；价廉,测定中质控样本的设置、数量及排列顺序,标本量不大，如少于30份，定性测定有1份接近cut-off的弱阳性和1份阴性质控样本应可以满足要求。样本量大，则可按比例增加。定量测定则要根据试验的测定范围，采用高、中、低三种浓度的质控样本。核酸提取时，质控样本要随机放在临床标本中间。至于在测定中的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。,临床基因扩增检验室内质控的独特性,即监测污染发生的阴性质控的设置。可包括1份阴性原血清样本、1份在标本核酸提取过程中带入的一个空管和仅含扩增反应混合液的管。,阴性原血清质控样本的功

22、能,监测实验室的以前扩增产物的污染；由实验操作所致的标本间的交叉污染；扩增反应试剂的污染。,在标本核酸提取过程中带入的一个空管的功能,监测实验操作过程中的实验室污染和标本间交叉污染.不能取代原血清阴性样本。,仅含扩增反应混合液的管的功能,监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴别性。,实验室是否发生污染的鉴别,可将一个或多个空管打开静置于标本制备区3060分钟，然后加入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混合液的管为阴性，则说明实验室以前扩增产物的存在。,统计学质控的特点,检验误差有两类，一是系统误差，一是随机误差。系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移，是由

23、操作者所使用的仪器设备、试剂、标准品或校准物出现问题而造成的，这种误差可以通过前述的措施方法加以控制，是可以排除的。随机误差则表现为测定SD的增大，主要是由实验操作人员的操作等随机因素所致，其出现难以完全避免和控制。,统计学质控的功能,统计学质控的功能就是发现误差的产生及分析误差产生的原因，采取措施予以避免。开展统计质量控制前，应将可以控制的误差产生因素尽可能地加以控制，这不但是做好室内质控的前提，也是保证常规检验工作质量的先决条件。,统计质控方法,基线测定质控规则的表达方式及定义 Levey-Jennings质控图方法 Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法 累

24、积和(CUSUM)质控方法“即刻法”质控方法,基线测定,最佳条件下的变异（Optimal conditions variance,OCV）和常规条件下的变异（Routine conditions variance,RCV）；当RCV与OCV接近，或小于2 OCV时，则RCV是可以接受的。以上为批间变异。批内变异的测定；室内质控物的测定准确度的评价。,临床基因扩增检验IQC统计计算问题,可使用质控样本扩增后的IU/ml来进行统计计算，也可用其对数值进行。由于基因扩增结果的原始数据通常很大，故使用其对数值来进行质控统计分析可能要更为方便一些。,质控规则的表达方式及定义,质控规则的表达方式 质控规则

25、的功能 常用质控规则的符号及定义,质控规则的表达方式,通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值13SD来表示。当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。,质控规则的功能,简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。,常用质控规则的符号及定义,符 号 定 义12S 一个质控测定值超出2s控制限。13S 一个质控测定值超出3s控制限。22S 两个连续的质控测定值同

26、时超出+2s或2s控制限。R4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的 差值超出4s控制限。41S 四个连续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。7T 七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变 化。10X 十个连续的质控测定值同时处于均值（X）的同一侧。,Levey-Jennings质控图方法,也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart 于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。,Levey-Je

27、nnings质控图,Levey-Jennings质控图基本的统计学含义,稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。如以3s为失控限，假失控的概率为0.3%。,“假阳性”的统计学室内质控方法,基于日常检验的阳性率比值(呈正态分布)直接概率计算方法（不呈正态分布）,“即刻”质控方法,“即刻法”的实质是一种统计学方法,即Grubs异常值取舍法 只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。,室内质控数据的评价,IQC为一集体活动，除实际测定者外，还应有另外一人对测定数据进行质检。不能将

28、IQC作为一个监察方法，当发现一次测定未达到质量标准时，应以建设性的而非批评的方式去探查失控的原因。除了将IQC数据作为日常质控外，还应定期评价累积数据以监测在测定操作中的长期变化趋势。评价应定期进行。,分析你已做的,每次实验结果的分析 表象与真象多次实验结果的综合分析 趋势的内在含义仪器设备的使用情况分析 维护与校准周期的有效性,弱阳性质控样本常见的失控原因,核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取

29、试剂的效率等。,阴性质控样本的失控原因,主要为扩增产物的“污染”和/或临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉“污染”,一个临床PCR实验室对全年室内质控结果的分析举例,IQC的局限性,IQC可能测不出的误差 测定前 测定中 测定后 样本鉴定不对 样本吸取不对 结果记录错误 样本贮存中变质 试剂加入不对此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一般要求小于0.1%，且应均衡地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。,影响临床基因扩增检验结果的最关键因素,产物“污染”（Carry-over)测定人员的操作：标本混淆；贴错标签、核酸提取等试剂,避免基因扩增检验假阳性结果的措施,严格的实验室分区；使

30、用带“滤芯”的吸头；设立“阴性”质控（与标本同时处理）；使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂；临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。,避免基因扩增检验假阴性结果的措施,避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：（1）纯化核酸；（2）标本重复双份测定；（3）稀释标本。使用“内质控”（Internal Control,IC)以避免由于试剂、扩增仪或标本处理不当所致的假阴性；须注意的是，如果靶浓度很高，可致在靶核酸和IC之间产生竞争，而使IC受抑制，此时IC可为阴

31、性。,室间质量评价（EQA）,EQAProficiency testing(PT),EQA 的程序设计,确定质评方案,定期发放质评样本；要求参加质评实验室报告结果的单位要一致，以便于统计；报告要清楚、简洁；要求参评实验室在测定EQA样本时，要以与常规样本完全相同的方式测定；对测定方法、试剂及仪器等归纳总结；对参评实验室的测定要有评价；EQA报告要迅速及时。,EQA质评样本,样本特征与患者样本应尽量一致样本浓度与试验的临床应用相适应在样本发放的条件下稳定不存在不可避免的传染危险性,EQA靶值,定性测定，应为明确的阴性或阳性定量测定，则提供参考方法值或参加实验室的修正均值或参考实验室均值或方法或归

32、组的方法均值,评价方法,特定参评实验室的评分根据其与其它实验室得分之间的关系，可分为绝对评分和相对评分两种模式。绝对评分就是根据已定的靶值对参评实验室测定的每份质评样本计分，然后再计算该次质评的总分，以得分的高低评价参评实验室的水平。相对评分则是将参评实验室质评得分与所有参评实验室的平均分进行比较，观察其得分在全部参评实验室中所处的位置。,相对评分和绝对评分的例子,相对评分：英国NEQAs绝对评分：美国CAP,采用何种评分方法较好？,建立一个质评体系，上述绝对评分和相对评分的方法均可以采用，其实质内容并无太大的差别，只不过是表现形式的不同，尤其是在定量测定。从室间质量评价对改善实验室测定质量的作用来看，究竟是采用上述哪一种或另外制定的评价方法其实并不重要，关键是要有一个评价方法，从而以其为标准去评价实验室的测定。,EQA对测定技术的评价,使用适当的统计学方法全面地对方法、试剂和单个参评实验室测定技术进行评价指明严重误差适当时评价测定的其它方面（如测定干扰）。,EQA的局限性,参评实验室没有同等的对待EQA样本和患者样本可能会妨碍给出不同结果的改良方法的发展在不同的EQA程序中，对实验室的评价可能不同,染色体差异1.23%(Fujiyama A,et al.Science,2002,295(5552):131-4),谢谢！,