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1、自身抗体检测及临床应用价值,张虹,自身抗体是诊断自身免疫性疾病的重要依据,自身免疫泛指机体免疫系统受某些内因、外因或遗传等因素作用产生针对自身正常或变性的组织、器官、细胞、蛋白质或酶类等自身抗原发生的免疫应答反应，出现自身抗体或自身致敏淋巴细胞的现象。因自身免疫招致组织器官损伤或功能障碍所致疾病称自身免疫性疾病(AID)。自身抗体是自身免疫性疾病的重要标志。,自身免疫性疾病的共同特征,1.可以有诱因，也可以无诱因，但多数病因不清。2.患者以女性居多，随年龄增加发病率有所增加。3.有遗传趋向。4.血清中有自身抗体或体内有针对自身组织细胞的致敏淋巴细胞。自身抗体在不同的自身免疫病中有交叉和重叠现象
2、。5.疾病的重叠现象,即一个病人可同时患一种以上自身免疫病。6.自身免疫病一般病程较长,病情发展和缓解呈反复交替现象,易成为终生痼疾。免疫抑制剂治疗可取得一定疗效。,自身抗体的意义,1.可帮助临床诊断，评价疗效，估计预后。2.自身抗体是自身免疫性疾病特征-称标志抗体，*标志抗体检出有助于临床医生确诊疾病*自身抗体的检测有助于临床医生更早发现疾病,自身抗体可以在AID临床发病前检测到,PBC患者任何临床症状前10年可检测到AMA（抗线粒体抗体）RA患者在临床症状前4-5年检测到抗CCP抗体,自身抗体的分类,抗细胞内抗原的抗体:抗细胞核成分的抗体(ANA)抗细胞浆成分的抗体(ANCA)抗细胞膜成分
3、的抗体:抗磷脂成分抗体 抗细胞表面抗原抗体:抗红细胞Rh抗原 抗细胞外抗原的抗体:RF、凝血因子,抗核抗体谱抗DNA抗体抗核糖体P抗体抗组蛋白抗体抗ENA抗体抗Sm抗体抗U1RNP抗体抗Ro/抗SSA抗体抗La/抗SSB抗体肌炎特异性抗体（MSA）抗合成酶抗体抗SRP抗体抗Mi2抗体与系统性硬化相关的抗体抗拓扑异构酶1抗体抗着丝点抗体 抗核仁抗原的抗体,抗中性粒细胞胞浆抗体C-ANCAP-ANCA抗磷脂抗体狼疮抗凝物抗心磷脂抗体2糖蛋白 抗内皮细胞抗体类风湿关节炎相关抗体 类风湿因子（RF）抗CCP抗体 抗核周因子抗体自身免疫性肝病相关抗体 SMA，LKM，SLA，AMA，Sp100,gp21
4、0等,抗核抗体（ANA),抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）传统定义：将针对细胞核内成分的抗体称为ANA。现在对ANA靶抗原的理解已从细胞核扩大到整个细胞。是指抗核酸（nucleic acid）和核蛋白（nucleoprotein）抗体的总称。,ANA的检测方法,间接免疫荧光法（IIF）:现多以Hep-2细胞（人喉癌上皮细胞）为底物（Ag），抗原抗体结合，加入荧光标记的二抗体。用荧光显微镜观察ANA荧光着染强度和免疫荧光图形（核型）。稀释待检血清可检测ANA效价,ANA常见核型,核型 对应抗原 相关疾病均质型 组蛋白和DNA 所有的CTD及药物性狼疮斑点型 ENA S
5、LE、SSc、pSS、MCTD周边型 n-DNA SLE、也见于SSc 核仁型 RNA多聚 酶 SSc、也见于SLE、pSS SCL-70着丝点型 染色体 CREST syn（局限性系统硬化症）,ANA的检测方法,酶免疫测定试验（ELISA-ANA)商品化的试剂盒，包括吸附有抗原的固相（微孔板）、酶标记的检测抗体、洗液、底物、终止液及阴阳性质控物。通过酶标仪读取OD值，跟cutoff值比较来界定阴性和阳性。,抗核抗体的分类,（1）抗ENA抗体 可提取性核抗原（extractable nuclear antigens，ENA）（2）抗组蛋白抗体（3）抗DNA抗体抗双链DNA抗体（抗dsDNA）抗
6、单链DNA抗体（抗ssDNA）。（4）抗着丝点抗体（5）抗核小体抗体,ENA,不同的自身免疫病可产生不同的抗ENA抗体。通过检测抗ENA抗体的类型及其组合，可综合诊断自身免疫病的类型。抗Sm抗体抗U1RNP抗体抗Ro/抗SSA抗体抗La/抗SSB抗体肌炎特异性抗体 JO-1与系统性硬化相关的抗体SCL-70,ENA检测方法,双向免疫扩散对流免疫电泳斑点酶免疫技术免疫印迹技术,免疫印迹技术（最常用）,欧蒙印迹法试剂盒用于体外定性检测血清或血浆中的人抗nRNP、Sm、SS-A（天然SS-A和Ro-52）、SS-B、Scl-70、Jo-1、CENP B、dsDNA、核小体、组蛋白和核糖体P蛋白等14
7、种不同抗原lgG类抗体。,免疫印迹技术(IBT),1.将提取的抗原,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后将各抗原区带转印至硝酸纤维膜上制成膜条。2.将待测血清加在已切成细条的硝酸纤维膜上,3.当再加入酶标记抗人IgG抗体,4.再加入酶的底物,出现显色反应。凡有抗体与膜上抗原结合的位置,均会因酶促反应而显色。参照此时抗原区带的分子量及各区带的相应位置,可辨读出各特异性抗体.,抗ENA抗体的主要类型及临床意义,抗Sm抗体 抗Sm是SLE的特异性标志之一，对SLE高度特异（超过90%），约5%-40%患者阳性，同时伴抗DS-DNA抗体和U1-RNP抗体阳性。抗u1-nRNP抗体 抗nRNP(nucle
8、ar RNP)：以抗核内的核糖核蛋白而得名。临床上应用较多的是u1RNP抗体。抗u1RNP抗体在混合性结缔组织病（MCTD）中几乎均为阳性，且其滴度很高；是区分结缔组织病和非结缔组织病的有力指标。2530的SLE患者存在该抗体，一般与抗Sm抗体一同出现。抗u1RNP抗体阳性的病人，常有双手肿胀、雷诺现象、肌炎和指（趾）端硬化。,抗SSA抗体,抗SSA/Ro 抗体 与各类自身免疫性疾病相关，最常见于干燥综合征（40-80%）。SLE（20-60%）与狼疮肾病的发生相关。抗天然SS-A（60kDa）抗体对SS和SLE的特异性高。抗Ro-52抗体不具有疾病特异性，而且还可与抗Jo-1和RNP抗体发生
9、交叉反应。既往认为抗SS-A靶抗原为分子量52KD和60KD，RO-52和RO-60是同一大分子复合体，现在认为RO-52和RO-60抗体并不属于同一抗体系统，两者是独立的抗体系统，而且具有不同的临床意义。,抗SSB/La抗体,在原发性SS病人中，抗SSA/Ro和抗SSB/La阳性率分别为60%和40%，它们是诊断干燥综合征的血清学标志。抗SSB抗体较抗SSA抗体诊断干燥综合征更为特异。另：SSA和抗SSB抗体阳性可造成新生儿狼疮及婴儿心脏传导阻滞等先天性心脏病。抗SSA和抗SSB抗体常与血管炎、淋巴结肿大、白细胞减少、光过敏、皮损、紫癜等临床症状相关。,抗Jo-1抗体,几乎仅见于或最常见于多
10、发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）或PM/DM重叠综合征。存在于35至40的肌炎患者中。临床表现为：肌炎、间质性肺疾病、关节炎以及常出现雷诺现象的一组临床表现的特征性；患者的手指侧面常出现角化过度，并伴有脱屑、裂纹和色素沉着，从而形成许多肮脏的横纹。即“技工手”.50至70发生间质性肺疾病。肌炎常常难以通过治疗达到完全缓解。,SCL-70抗体,抗拓扑异构酶1抗体（抗scl 70抗体）：存在于25至75的患者；主要见于患有弥漫型硬皮病以及存在系统性损害（特别是肺间质变）的患者。抗体滴度与疾病活动性无关。,抗DNA抗体,已确认出两大类抗体特异性：天然的双链DNA（dsDNA）：SLE患者的特征性标志变
11、性的单链DNA（ssDNA）抗dsDNA抗体在SLE的发病机制中起重要作用，SLE并发的狼疮性肾炎是由该抗体介导的免疫复合物病，抗dsDNA抗体可形成多种冷沉淀而致血管炎，SLE肾炎及典型的蝶形红斑均与该抗体有关。抗dsDNA抗体诊断SLE的特异性可达95%100%，但其敏感性仅为30%50%，因此抗dsDNA抗体阴性不能排除SLE的诊断。抗体水平与疾病活动度相关，随着疾病活动的控制，抗dsDNA抗体滴度可以下降或消失。,抗组蛋白抗体（Anti-Histone Antibody，AHA）,组蛋白是染色质基本结构-核小体的重要组成部分；在药物性狼疮的患者中出现率很高（78-95%）；在多种结缔组
12、织病中出现。服用异烟肼的病人中最高，但临床上并没有出现狼疮的临床症状。,抗组蛋白抗体,组蛋白有H1,H2A,H2B,H3,H4亚型 抗H1 H2A H2B H3 H4系统性红斑狼疮+长期服异烟肼+类风湿关节炎+,抗核小体抗体（antinucleosome antibodies,AnuA）,核小体是染色体的功能亚单位，是DNA与组蛋白形成的复合体，存在于细胞核中，核小体是SLE主要的自身抗原；AnuA对SLE诊断的敏感性和特异性分别为56.0%-64.2%和97.0%-98.8%，敏感性优于抗dsDNA，是SLE的标记抗体之一。AnuA可出现于SLE疾病进程的各个时期，并且是狼疮肾炎的标记性抗体
13、。AnuA与抗dsDNA抗体可不同时出现，AnuA出现早于抗dsDNA抗体，这对SLE的早期诊断更为有利。,核糖体P蛋白抗核糖体P蛋白为SLE特异性自身抗体，检出不高，通常为10%，该抗体与疾病的活动度不相关。抗着丝粒抗体90的局限性系统性硬化症CREST综合征患者存在该抗体；见于患有原发性或继发性雷诺病的患者。,系统性红斑狼疮(SLE),靶抗原阳性率(%)dsDNA标志性抗体 30-90Sm标志性抗体 5-30核糖体P蛋白标志性抗体 5-15核小体标志性抗体 50-95组蛋白 40-80U1-nRNP 15-40SS-A 20-60SS-B 10-20,新生儿红斑狼疮（NEL）靶抗原阳性率(
14、%)SS-A 100药物诱导的红斑狼疮（DIL）靶抗原阳性率(%)组蛋白 95原发性干燥综合征（SS）靶抗原阳性率(%)SS-A 40-95SS-B 40-95混合性结缔组织病（MCDT）靶抗原阳性率(%)RNP 95-100,弥漫型进行性系统性硬化症靶抗原阳性率(%)Scl-70标志性抗体 25-75局限型进行性系统性硬化症靶抗原阳性率(%)着丝点 80-95多发性肌炎和皮肌炎（PM/DM）靶抗原阳性率(%)Jo-1 25-35,自身免疫性肝病相关抗体,是与自身免疫密切相关的特殊类型的肝病，其诊断和治疗完全不同于一般的慢性病毒性肝炎自身免疫性肝炎(AIH)原发性胆汁性肝硬化(PBC)原发性硬
15、化性胆管炎(PSC)自身免疫性胆管炎（AIC）重叠综合征每种自身免疫性肝病都具有特征性自身抗体谱，自身抗体检测对自身免疫性肝病的诊断及鉴别具有重要意义。,原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC）,女性；胆酶升高（ALP,r-GT）为主，碱性磷酸酶（ALP）/AST3；IgM明显升高,胆汁酸,血脂及胆固醇升高;肝内小胆管的非化脓性炎症和梗阻，淤胆；肝内阻塞性胆汁性肝硬化；常合并其他自身免疫病如SS、桥本氏甲状腺炎等。,抗AMA-M2（抗线粒体抗体）,该抗体为原发性胆汁肝硬化（PBC)的特异性指标，对PBC特异性最强(95%),敏感性最高(95%)。可早于发
16、病10年查出抗体。PBC诊断不及时危害大PBC早期隐匿，晚期疗效甚微。晚期确诊PBC患者死亡率很高。PBC误诊率可高达90%。最常见误诊为：慢性病毒性肝炎。某传染病医院数据（2001-2010年)显示：近半数PBC患者伴有乙肝病毒感染，疾病还同时伴发各种类型肝炎（乙肝最常见）。,自身免疫性肝炎 autoimmune hepatitis,AIH,AIH临床特点：大多隐匿起病,女性多见（女：男=4-6：1）类似病毒性肝炎的症状和体征：疲乏无力、右上腹不适、肝肿大、黄疸、腹水肝功能异常：肝酶（ALT、AST）升高为主，明显高于胆酶，AST/ALP3；血清IgG升高，1.5倍,r-球蛋白2倍；各种病毒
17、学指标 检查均为阴性;（自免肝禁忌用干扰素，诊断自免肝必须排除病毒性肝炎）。,AIH（自免肝）相关的自身抗体,是AIH诊断和分型的重要依据和必备条件抗核抗体（ANA）抗平滑肌抗体（SMA）抗肝肾微粒体抗体（LKM）抗肝细胞溶质蛋白1抗体（LC-1）抗可溶性肝抗原抗体（SLA）抗肝胰抗体（LP）,自身免疫性肝炎的分型,I型:最常见，约占80%抗平滑肌抗体（SMA），ANA：常同时出现（85%-90%），ANA及SMA被公认是 诊断I型AIH的特异性抗体;II型:LKM-1(肝肾微粒体抗原）；LC-1(肝细胞胞质抗原)少见，儿童多见 III型:SLA(可溶性肝抗原)LP(肝胰抗原),原发性硬化性胆
18、管炎（primary sclerosing cholangitis,PSC,病变特征为胆管广泛炎症纤维化、梗阻、狭窄，进而发生胆汁性肝硬化，临床特点为阻塞性黄疸。PSC血清免疫球蛋白常增高,以IgM多见。ANCA阳性在PSC高达87%。血清中可发现ANA和SMA，但滴度都比较低，一般没有抗线粒体抗体，这一点与PBC相反。胆管造影(ERCP)显示有硬化性胆管炎的典型改变，肝内外胆管狭窄与扩张相间而呈串珠状改变（决定性）。,ANCA-抗中性粒细胞胞浆抗体,ANCA代表一组抗中性粒细胞胞浆特定的成分为靶抗原的抗体谱。其靶抗原成分包括：丝氨酸蛋白酶3（PR-3）、髓过氧化物酶（MPO）、通透性杀菌蛋白
19、（BPI）、丝氨酸蛋白酶、人白细胞弹性蛋白酶（HLE）、乳铁蛋白（LF）、组织蛋白酶G（CG）、葡萄糖醛酸酶、溶菌酶等。在显微镜下观察，常见到两种结合类型：C-ANCA：胞浆中细颗粒类型，主要靶抗原为PR-3；P-ANCA：核周染色。其靶抗原主要为MPO；A-ANCA或X-ANCA：前两者的混合物，非典型ANCA,ANCA的测定,1 间接免疫荧光法(IIF)最常用 胞浆型 c-ANCA 核周型 p-ANCA 不典型 a-ANCA 2 免疫印迹法,细胞质呈弥漫性颗粒样染色（不均匀）,环绕细胞核周围的细胞质亮染,ANCA两种荧光染色型,核周型ANCA（pANCA）胞浆型ANC（cANCA）,C-A
20、NCA/PR3-ANCA,丝氨酸蛋白酶3（PR3）为C-ANCA的主要靶抗原，约占C-ANCA的80%90%。C-ANCA诊断WG的特异性大于90%，外加PR3-ANCA可超过95%。敏感性取决于疾病的活动性和病期阶段，在初发不活动的韦格纳肉牙肿（WG）中，阳性率只有50%，而活动性典型的WG，几乎100%阳性。总体敏感性为6070。C-ANCA滴度与病情活动一致，强烈的致病作用。常被作为WG，判断疗效、估计复发的指标。在HIV感染和阿米巴肝脓肿的患者中也可能检测到该抗体。PR3-ANCA在其他原发性血管炎中也可被检测到，如MPA(显微镜下多动脉炎）、坏死性新月体型肾小球肾炎（NCGN）、PA
21、N（结节性多动脉炎）等。,P-ANCA/MPO-ANCA,主要靶抗原为：抗髓过氧化物酶（MPO），弹性蛋白酶、乳铁蛋白及其它尚未被确认的胞质成分为抗原。主要与50显微镜下多动脉炎（MPA）、坏死性新月体型肾小球肾炎（NCGN）等相关。MPO-ANCA还可见于其它一些疾病，如PAN（结节性多动脉炎）、抗肾小球基底膜疾病（抗GBM病）、WG、SLE(10%15%）、RA伴关节外损害及血管炎、药物性狼疮、Felty综合征(类风关合并WBC少）等。MPO-ANCA与原发性血管炎相关不及PR3-ANCA与WG相关性那样紧密。但每一个怀疑血管炎或肾小球肾炎患者，只要原因不明，就应查ANCA。体内、体外资料
22、显示MPO-ANCA参与血管炎相关疾病的致病机理。MPO-ANCA与病情活动相关，可用于判断疗效、估计复发和指导治疗。,ANCA不仅与原发性小血管炎相关,也可见于许多其它炎症性疾病,例如炎症性肠病,包括溃疡性结肠炎和克隆氏病;自身免疫性肝胆疾病,如原发性硬化性胆管炎;类风湿性关节炎;和某些肺部非感染性炎症性疾病,如囊性纤维化、肺间质纤维化等。但上述ANCA相关的疾病并不识别PR3和MPO,其特异性ANCA靶抗原为其它胞浆成分。,甲亢治疗监测,血管炎病变不仅累及血管本身，还累及血管所支配的组织和脏器，有些可以致命。甲亢：目前我国女性人群患病率达2%。甲亢未经治疗，ANCA阳性率可达到3.5%，治
23、疗甲亢（血管炎）ANCA阳性率35%，ANCA阳性必须停药。,类风湿关节炎相关抗体,类风湿因子（Rheumatoid Factor,RF）抗环瓜氨酸肽（Cyclic citrullinated peptide，CCP）抗体 抗核周因子（antiperinuclear factor，APF）抗角蛋白抗体（antikeratin antibody，AKA）抗钙蛋白酶抑制蛋白抗体(ACAST)抗RA33抗体,类风湿因子（RF）,抗原：为变性的IgG Fc段 通常为IgM型是诊断RA的标准之一，不是唯一标准，更非RA特有,作为类风湿关节炎（RA）的筛选试验有一定的价值，至少75的患者RF（）作为血清阴
24、性脊柱关节病区分标准。正常人2%阳性，老年人可达5%阳性。RF与其他蛋白、半抗原有交叉反应。多种结缔组织病（SLE，SD，SS，PM/DM）感染疾病（SBE，TB，hepatitis）,肝硬化，弥漫性肺纤维化，结节病等均可阳性。病后半年才产生，有关节外表现者，滴度高。持续高滴度RF预示疾病严重，预后差。,抗环瓜氨酸肽（Cyclic citrullinated peptide CCP）抗体,抗CCP抗体所针对的靶抗原是APF、AKA的共同抗原决定簇，是由19个氨基酸残基组成的瓜氨酸多肽链，ELISA 法检测。抗CCP 抗体对RA诊断的特异性高（90.4%98%），敏感性约80%；有助于RA的早期
25、诊断：该抗体可先于RA临床表现，90%以上的血清抗CCP抗体阳性的未分类的关节炎在年内进展为RA。与RA的活动性及预后相关,浓度高往往提示预后不佳，发生关节侵蚀的危险大。是RA最好的独立参数预测指标。,RA自身抗体谱及临床意义,RF60RA中出现，量与RA活动性及严重 性呈正相关，亦在其它CTD出现 抗CCP在50RA中出现（聚角蛋白微丝蛋白）特异性高，95AKA（抗角蛋白抗体）在40RA阳性，特异性90%APF（抗核周因子）在52RA阳性，特异性90%抗RA33RA阳性率为35抗Sa 在部分RA阳性 以上抗体阳性有助于早期RA及不典型RA的诊断和早期开展治疗，改善预后。,风湿病学中的自身抗体
26、：结论,单单出现自身抗体并不一定是风湿性疾病。试验结果阴性常常并不能除外某种风湿性疾病。必须要根据临床才能作出风湿性疾病的最终诊断。将抗体检测与临床表现结合起来，能够帮助我们鉴别这些数量众多的风湿性疾病，同时抗体的检测也有助于对疾病的活动度进行监测。,其它自身抗体及临床意义,胰岛细胞抗体（ICA)1型糖尿病高度预测性胰岛素自身抗体（IAA)1型糖尿病 谷氨酸脱羧酶抗体（GAD)1型糖尿病 抗血小板抗体 自身免疫性血小板减少症抗红细胞抗体 溶血性贫血,HLA-B27,HLA即主要组织相容性抗原，又叫人类白细胞抗原。HLA位于人类第6条染色体的短臂上，包括A、B、C、D、DR、DQ、DP七个位点的
27、164个抗原。HLA-B27是B位点上的抗原。辅助诊断：强直性脊椎炎,HLA-B27相关疾病,强直性脊柱炎,Ankylosing Spondylitis，AS患病率：0.3%，20-30岁，男女比例 10:1，有家族倾向；主要侵犯：中轴关节（骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织），可伴发外周关节及关节外表现，严重者发生脊柱畸形和关节强直。B27检测可作为有相关症状或高危人群AS早期的筛选方法！,HLA-B27与AS,HLA-B27检测（ELISA),原理：应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中HLA-B27水平。用纯化的B27抗体包被微孔板，依次加入HLA-B27抗原（待检标本）、生物素化的抗HLA-B27抗体、HRP标记的亲和素，形成双抗体夹心反应，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HLA-B27呈正相关。,自身抗体临床检测至关重要,谢谢！,
