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1、荧光显微术,1.了解荧光显微镜的基本构成和基本原理。2.初步掌握荧光显微镜的调节步骤和使用。,实验目的,实验用品,Olympus荧光显微镜，载玻片，盖玻片，擦镜纸，吖啶橙染料等实验用材料。,实验内容,一、荧光显微镜的成像原理二、荧光显微镜的基本结构三、荧光显微镜的使用方法四、观察动植物细胞的自发荧光和继发性荧光,一、显微镜的成像原理,荧光显微镜是利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。自发荧光:组织、细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所呈现的荧光，称为自发荧光。继发性荧光:组织、细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和
2、组织细胞内的某种成分结合后而呈现的荧光为继发性荧光。,二、荧光显微镜的基本结构和光路图,1.基本结构:光源：超高压汞灯,用以产生强光照(含大量紫外光,蓝紫光)滤片系统:激发滤色镜，提供一定波长范围的激发光.阻断滤色镜,透过相应波长范围的荧光,阻断 或吸收剩余激发光.二向分色镜，透射长波光线和反射短波光线的功能.荧光物镜普通显微镜,荧光显微镜结构图,荧光显微镜的光路图,三 荧光显微镜的使用方法,1.汞灯的安装:切断电源,从插座上拔下电源线.开启灯室,将汞灯安装到灯架上.严防手指触摸灯管,特别是中心球状部分,以免污染 汞灯装入灯室,封上灯室盖后,方可按通电源.,（一）荧光显微镜的调整方法,2.汞灯
3、的点亮:确信各连接部分皆处于正常状态 接通启动器电源开关,按下起动钮,汞灯点亮,经2-3min,电弧趋于稳定.点亮后 15min内,勿切断电源,一旦汞灯熄灭,在5min或稍长时间内,不许重新点亮,待汞灯冷却后,始能再次点亮.,3.汞灯的调中:开启光阀.开放孔径光阑和视场光阑至最大开度,即“Min”-“Max”.旋转物镜转换器,无物镜的空洞进入光路,旋下防尘盖光线射向镜台.载物台上放一白纸,让汞灯电弧像投在其上.用灯室外的聚焦杆,使电弧像在白纸上聚焦，并用调中螺钉,调中汞灯。,4.滤色镜系统的配合使用:该荧光显微镜具激发滤色镜,阻断滤色镜和二向色镜等。,5.样品聚焦:经荧光染料染色的样品放在载物
4、台上,先用溴钨灯透射照明,用低倍物镜聚焦,待寻找到最佳影像后,熄灭溴钨灯改用汞灯.点亮汞灯,嵌入系统滤色镜 使用 UVFL 40X(Oil)和 UVFL 100X(Oil)油浸物镜,应用无荧光浸油,物镜的内装可变光阑应适当缩小,以增大影像反差和清晰度.在UVFL 40X(dry)物镜内装有校正环,对较薄或较厚的盖片进行球面校正.,6.缩小光阑开度 视场光阑(F)和孔径光阑(A)的开度,在观察样品时应朝“Min”向转动,使其适当缩小.7.光阀的使用 在荧光观察暂短中止时,可用光阀阻断光路,勿 熄灭汞灯,以免减短其使用寿命.,（二）荧光镜检样品的制作,1.不能使用本身能产生荧光的药剂2.切片标本不能太厚3.因石蜡可产生青色荧光，采用石蜡制片时，脱蜡必须彻底。切片进入水后，应充分水洗，再经荧光染料处理。4.最好采用萤石玻璃制成的载玻片、盖玻片。5.封片时可采用甘油等无荧光的封固剂。,材料:藻类,鸭趾草下表皮,动物结缔组 织,血细胞,花粉.染液:0.01%丫啶橙染液.观察藻类，鸭趾草下表面叶绿体的自发荧光丫啶橙染花粉,血细胞,疏松结缔组织。,四、观察动植物细胞的自发荧光和继发性荧光,1.影响荧光显微镜成像质量的因素2.激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及区别？两者有何关系？怎样选用？,思考题,
