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1、血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳,第六组,蛋白质的分离,蛋白质是生物大分子化合物，具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点蛋白质分离纯化的方法主要有：盐析、透析、超离心、电泳、离子交换层析、分子筛层析等方法。,透析,超速离心,凝胶过滤层析,离子交换层析,电泳技术的原理,电泳蛋白质在一定的pH溶液中可带有电荷，成为带电颗粒，在电场中向相反的电极方向泳动。由于蛋白质的分子量和电荷量不同，其在电场中的泳动速率也不同，从而将蛋白质分离成泳动速率快慢不等的条带。电荷的来源 蛋白质带有可解离的氨基（-NH2）和羧基(-COOH),是典型的两性电解质，在一定PH条件下会解离带上电荷,COO-COO-COOH+H
2、+H+Pr Pr Pr+OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PHPI,迁移率电场力 F=EQ（E：电场强度，Q：电荷)阻力 F=6（：半径，：介质粘度）/E表示单位电场强度时粒子运动的速度，称为迁移率，也称位泳动度，以表示：=/E=Q/可见，离子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质，即其所带的电荷和形状。不同的粒子有不同的迁移率，因此电泳一定时间就可分开它们。,样品性质 与分离样品所带电荷成正比，与样品相对分子质量成反比。电场强度 电压越高，带点粒子移动越快。缓冲液的性质 缓冲液的PH值距等电点越远指点所带静电荷越多，迁移速度越快；反之越慢。离子强度等于1/2ciz
3、i2支持介质 理想电泳支持介质应是网状结构、不带电荷、对被分离物质无吸附作用的惰性材料。温度,影响电泳分离效果的因素,电泳的分类,1、根据固体支持物种类的不同 纸质电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳2、根据电泳装置不同 薄膜电泳 垂直板电泳 平板电泳 垂直圆盘电泳,醋酸纤维素薄膜电泳,琼脂糖凝胶电泳,琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场力作用下能产生较强电渗作用，因此用于作为电泳支持物。琼脂糖凝胶电泳具有：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳；电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；可直接用于紫外检测；易染色易洗脱等优点。尤其适
4、合核酸的分离。,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰氨凝胶电泳,实验目的1、掌握电泳的基本原理，了解电泳仪、电泳槽的基本结构与功能。2、熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本过程。,实验原理,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成1225个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。根据有无浓缩效应可分为：连续系统与不连续系统，其中不连续系统因具有浓缩效应，分
5、离条带清晰度及分辨率较佳应用更为广泛，本次试验应用的为不连续系统。,三大效应,浓缩效应：浓缩胶的浓度小于分离胶的浓度，因凝胶孔径的不连续使样品迁移受阻而压缩成很窄的区域，从而提高分离效果。缓冲液离子成分、PH的不连续性也能造成浓缩效应：电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶（浓缩胶）中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子
6、追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25m的厚度。分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。电荷越多迁移越快,不连续系统,有效迁移率=迁移率 解离度氯离子蛋白质阴离子甘氨酸阴离子,垂直板电泳的优点：,表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。可多个样品的电泳胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高。胶版薄而透明，可制成干板，便于长期保存与扫描。可进行双向电泳。
7、血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只可以分离出56条区带，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分离出数十条区带。,实验器材与试剂器材圆盘电泳槽、电泳仪、脱色摇床、染缸、微量加样器、注射器、小烧杯试剂（缓冲液PH值准确配置后用PH计调试）,实验操作凝胶柱的准备,（凝胶溶液配制表见教材表4-4）,取玻璃管，一段封口,加入分离胶溶液(7cm),加入蒸馏水,制备分离胶应迅速,为了使表面平整，与空气隔绝,加入分离胶溶液(7cm),制备分离胶应迅速,加入分离胶溶液(7cm),制备分离胶应迅速,加入分离胶溶液(7cm),制备分离胶应迅速,取玻璃管，一段封口,取玻璃管，一段封口,取玻璃管，一段封口,装柱 将凝胶管插入电泳
8、槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入为宜，下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜),加样 取血清12L，7号试剂12L混匀，品均加入4管，每管6L.（加样枪不可插入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液引起样品扩散。）电泳 接通电源，上负下正，先调节电流1mA/管，待示踪染料进入分离胶后调节为23 mA/管，待示踪染料离管下口0.5cm时切断电源。剥胶 注入蒸馏水做润滑剂，针头螺旋式前进，缓缓剥离。固定、染色及漂洗 将凝胶柱浸入8号剂中泡10min，进行固定，用9号剂染色10min，用清水冲洗，放入10号剂中漂洗脱色。,结果示意图,2 1,注意事项：,丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测pH值是否失效。失效液不能聚合。加速剂（TEMED）要密封保存，过硫酸溶液现配现用，防止氧化失效。配好胶后应尽快灌胶（不要形成气泡）切记装柱后应用蒸馏水密封灌胶和电泳时要注意排气泡加样时不能损伤凝胶表面电泳时凝胶管不能漏水，并且与电泳池垂直固体胶切忌倒入水池,The end!,谢谢！,
