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1、血清总蛋白和白/球比值测定,实验目的：,1、熟悉血清总蛋白的测定方法：双缩脲法2、掌握血清总蛋白测定的临床意义3、熟悉血清白蛋白的测定方法：溴甲酚绿法4、掌握血清白蛋白测定和白蛋白与球蛋白的含量比（A/G）测定的临床意义,一、血清总蛋白的测定,实验原理：1、双缩脲反应：两个尿素分子缩合生成双缩脲（H2NOCNHCONH2)，在碱性溶液中与铜离子作用，生成稳定的紫红色配合物，即双缩脲反应。CuSO4的碱性溶液称双缩脲试剂。双缩脲+铜离子 紫红色2、蛋白质的定量测定：蛋白质与双缩脲相似，分子中的肽键能与双缩脲试剂形成紫色配合物。这种紫色配合物在540nm处有明显吸收峰。吸光度在一定范围内与蛋白质含
2、量成正比，常用于蛋白质的定量测定。,生理盐水,双缩脲试剂,蛋白质标准液,待测血清稀释液,生理盐水：氯化钠0.9g溶于10ml蒸馏水。双缩脲试剂：硫酸铜3.0g溶于500ml蒸馏水，加酒石酸钾钠9.0g，完全溶解后，加入24%氢氧化钠100ml，用蒸馏水稀释到1L，置于聚氯 乙烯瓶内盖紧保存。蛋白质标准溶液：收集混合血清，经凯氏定 氮法定值，用作蛋白质标准液。储存于冰箱中备用。也可用10mg/mL牛血清白蛋白替代。待测血清用生理盐水按1:10稀释。,实验步骤：,混匀，37度水浴放置10min，以空白管调零点，在540nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。计算:血清总蛋白含量=*蛋白质标准液浓
3、度*稀释倍数（g/L）,取3支试管，按下表操作。,临床意义：,1、血清总蛋白浓度增高（1）血液浓缩，导致总蛋白浓度相对增高：严重腹泻、呕吐、高烧时急剧失水、休克、慢性肾上腺皮质功减退，血清总蛋白浓度可明显升高。（2）血浆蛋白质合成增加：主要见于球蛋白合成增加，如多发性骨髓瘤患者，其蛋白含量可超过50g/L。,2、血清总蛋白浓度降低（1）血液稀释，导致总蛋白浓度相对降低：如静脉注射过多低渗溶液或因各种原因引起的钠、水潴留。（2）摄入不足和消耗增加：食物中长期缺乏蛋白质，慢性胃肠道疾病引起的消化吸收不良，患消耗性疾病等，均可造成血清蛋白浓度降低。（3）合成障碍：主要见于肝脏患疾。血浆清蛋白及大部分
4、球蛋白均由肝脏合成，肝功能严重损害时，血浆蛋白质的合成量减少，其中以清蛋白浓度降低最为明显。（4）蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，大量失血。,1、双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是配合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾是抗氧化剂，防止碱性酒石酸自动还原。2、由于各种血清蛋白质的相对分子质量不同，古其浓度不宜用mol/L表示，而用g/L表示。3、高脂、黄疸及溶血标本应做血清空白对照来校正误差。4、本法绘制的标准曲线是一条通过原点的直线，在浓度小于100g/L时呈良好的线性关系。,注意事项：,二、血清白蛋白的测定,实验原理：1、溴甲酚绿法：在不分离血清中白蛋白的情况下直接测定白蛋白的
5、一种方法。白蛋白具有与阴离子染料结合的性质，在pH=4.2的环境中，带正电荷的白蛋白（pI=4.9）与阴离子染料溴甲酚绿结合，由黄色变为蓝绿色。白蛋白+溴甲酚绿 蓝绿色复合物 2、白蛋白含量的测定：蓝绿色的深浅与白蛋白的浓度成正比，因此可直接测定血清白蛋白的含量。,溴甲酚绿储存液：BCG 419mg溶于10ml 0.1mol/L NaOH，加NaN3 100mg，定容至1L，储存于棕色瓶中备用。0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH=4.2）：分别配制 0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠溶液，按体积比 12.3:7.7 混合。每1L混合液加入NaN3 100mg。30%聚氧化乙烯月桂醚溶液：取Bri
6、j-35 30g，加少量水，60度水浴溶解加水至100ml。BCG应用液：BCG储存液 250ml、0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH=4.2)750ml、30%Brij-35混合而成。标准蛋白溶液(10mg/ml)：称取人白蛋白 1.00g，用生理盐水溶解并定容至100ml。,实验试剂：,实验步骤：,1、白蛋白标准曲线的绘制 取4支试管，按下表稀释标准液。,各管混匀后，另取5支试管，按下表操作。,混匀后以空白管校零，立即比色，比色波长为620nm,以吸光度为纵坐标，相应管中的白蛋白浓度为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。2、血清白蛋白的测定 用生理盐水按 1:10 的比例稀释血清，取稀释后的血
7、清0.2ml，加入BCG应用液 5.0ml，混匀后立即同上比色，读取吸光度，并从标准曲线上查出相应的白蛋白浓度。3、白蛋白与球蛋白的含量比(A/G)用双缩脲法测定血清标本中的总蛋白浓度，用总蛋白浓度减去白蛋白浓度即得球蛋白浓度，并可求得白蛋白与球蛋白的含量比：白蛋白与球蛋白含量比=,临床意义：,（1）血清白蛋白浓度增高：常见于严重脱水所导致的血浆浓缩。（2）血清白蛋白浓度降低：在临床上比较重要和常见，通常与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要见于大出血和严重烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿、肝功能受损、肠道肿瘤及结核病伴慢性出血、营养不良和恶性肿瘤等。当血清白蛋白低于20g/L时，临床上出现水肿。（3）白蛋白与球蛋白的含量比：正常范围为1.52.5。某些病人可同时出现白蛋白减少和球蛋白升高的现象，严重者白蛋白与球蛋白的含量比小于1.0，这种情况称为A/G倒置。,（1）BCG除与白蛋白结合外，还可与球蛋白及球蛋白结合，但与后者结合速度较慢，其显色强度分别为白蛋白的20%及10%，因此本方法操作中应控制比色时间，在BCG加入后30s内完成测定，避免球蛋白参与反应。（2）BCG本身是一种pH指示剂，变色域为pH=3.8（显黄色）5.4（显蓝绿色），因此控制反应液的pH值是本法测定的关键。,注意事项：,谢谢观赏！,
