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1、血浆蛋白和尿微量蛋白检测及其临床应用,杨春林,血浆蛋白的组成十分复杂，目前还不知道血浆蛋白的确切种类和数量。保守地估计组成性血浆蛋白约有500种，它们多为糖蛋白,血浆蛋白是血浆固体成份中含量最多、组成复杂、功能广泛的一类化合物。占血浆固体成份90%左右,目前已经研究的血浆蛋白质有300多种,分离出的纯品约100来种，除免疫球蛋白外，主要由肝细胞合成。血浆蛋白执行着人体的许多生物功能，在人类健康与疾病中有着重要的意义，人类很多疾病可引起血浆和体液中的蛋白质性质和含量的改变，因此，测定和分析血浆和体液中的蛋白质变化在临床上有重要价值。,尿微量蛋白是指用常规定性或定量方法难以检出的一些蛋白质。尿微量
2、蛋白的检测对早期原发肾脏病及其他相关疾病引发的早期肾脏病变的诊断和治疗 有着非常重要的价值，尿微量蛋白的检测为临床上监测肾脏及某些其他器官功能状态，提供了可靠指标。目前已检出的尿微量蛋白种类、数量较多，其各自的理化特性、合成部位、生理功能都不尽相同。我们科目前已开展检测的有：尿白蛋白（AIb）、尿转铁蛋白（TRF）、尿IgG、尿轻链（、）、尿2微球蛋白（2M）、尿1微球蛋白（1 M）、尿NAG等。,一、血浆蛋白和尿微量蛋白测定方法的进 展二、各种血浆蛋白和尿微量蛋白检测的临 床应用,一、血浆蛋白和尿微量蛋白测定方法的进展（一）比色法、比浊法（二）电泳分离法（三）免疫测定法,（一）比色法、比浊法
3、早期人们用比色法、比浊法测定人体血浆和体液中的蛋白质，如用双缩脉法、溴甲酚绿法测定血浆中的总蛋白、白蛋白等，用磺基水杨酸测定尿液中的蛋白质，这二种方法的优点是操作简单，重复性好，试剂稳定，成本低。但灵敏度和特异性较低，适用于测定人体中的常量蛋白。而对于人体中含量少的微量蛋白和一些特殊蛋白用上述方法就无法进行检测。,（二）电泳分离法电泳法分离法，最初以滤纸作为支持物，后来发展为醋酸纤维膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯胺凝胶作为支持物，对血清和体液中的蛋白质进电泳分离，早期的滤纸和醋酸纤维膜作支持物可将血清蛋白分为白蛋白，1球蛋白、2球蛋白、球蛋白和-球蛋白等。现在用聚丙烯胺作为支持物的电泳方法，可分离 1
4、00 种以上的血清蛋白质，可对尿液中的蛋白质进行分离。电泳法优点是可较好地分离血清和体液中蛋白，其缺点是操作繁琐，试验时间长。,（三）免疫测定法1 免疫扩散法 其存在较多缺点，如操作繁琐，试验需要时间较长（18-48小时），定量精确度差等。2 免疫电泳法 虽有较高的分辩力，但蛋白质在图谱上定位困难，且不能定量，临床应用范围不广，仅用于异常蛋白成分检测。3 免疫浊度法,免疫浊度测定,Ag+Ab,Ag Ab,免疫比浊测定,免疫浊度法是利用抗原、抗体在缓冲液中反应，形成抗原-抗体免疫复合物颗粒，此复合物颗粒分子量较大，在缓冲液形成沉淀析出，使反应液产生浊度，在抗体过量的前提下，通过光束时，悬浮的免疫
5、复合物颗粒所产生的透射、散射光速率变化强弱与抗原浓度成正比。速率峰值经微电脑处理转换成抗原浓度。特点是敏感、精确、快速、和简便。,免疫浊度法根据检测器的位置及接收光信号的性质分为：透射比浊法散射比浊法,透射比浊法和散射比浊法检测示意图,Rate NephelometryFixed Time Kinetic,测定原理,速 率 散 射 法 定 时 动 态,二 各种血浆蛋白和尿微量蛋白检测的 临床应用,我科的西门子特定蛋白仪可检测项目,ADnase B Albumin1-Antitrypsin1-acid-glycoprotein2-macroglobulinApo A-IApo A-IIApo B
6、Apo EASLAT-III2-microglobulin,血清/血浆:,C1-inhibitorC3C4CeruloplasminHigh Sensitivity CRPCystatin CFerritinFibrinogenFibronectinHaptoglobinHemopexinIgAIgEIgG,IgG-subclasses 1-4IgMIg-light chain,kappaIg-light chain,lambdaLp(a)MyoglobinPlasminogenPrealbuminRetinol binding proteinRFSerum Amyloid ATotal pr
7、oteinsoluble Transferrin ReceptorTransferrin,测试项目,Albumin1-microglobulin2-macroglobulin2-microglobulinIgGIg-light chain,kappaIg-light chain,lambdaTotal protein Transferrin,尿液,AlbuminIgAIgGIgMTotal protein,CSF,60个测试项目,IgApIgMpIgEs,血清/血浆,涵盖最广泛的临床检测指标,免疫功能:IgA、IgG、IgM、C3、C4、Kap、Lam、IgG subclasses 1-4、I
8、gE、C1抑制物肾脏功能:白蛋白、转铁蛋白、IgG、a1-微球蛋白、B2-微球蛋白、a2-巨球蛋白、Kap-轻链、Lam-轻链、Cystatin C感染性疾病:CRP、a1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、a1-抗胰蛋白酶、铜兰蛋白、纤维蛋白原、SAA类风湿性疾病:RF、ASL、CRP、ADNaseB心血管疾病:ApoA-I、ApoB、ApoA II、ApoE、Lp(a)、肌红蛋白、纤维蛋白原、hsCRP营养监测:前白蛋白、白蛋白、视黄醇结合蛋白、转铁蛋白、铁蛋白出/凝血疾病:纤维蛋白原、AT3、纤溶酶原贫血:触珠蛋白、转铁蛋白、铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体其他:CER、CDT,我科已开展的血浆和体液特定
9、蛋白项目:,IgA、IgG、IgM、K-轻链、L-轻链、C3、C4、Cystatin C、ALB、TRF、IgG、1-M、2-M、TP、NAG、apoA-I、apoB、Lp(a)、肌红蛋白、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、HCY、纤维蛋白原、hsCRP、RF、ASO、CRP、AAG、CER、PA、RBP等。,感染性疾病,在炎症和组织坏死时，血浆某些蛋白质会出现特征性的变化，称为急性时相反应。这些指标比传统的炎症指标如发热、白细胞升高及分类异常、血沉加速能更早期反映炎症和和感染情况。另外，急性时相反应蛋白增加的持续时间不一样，因此，有助于准确判断炎症的发展过程。,急性时相反应蛋白急性时相反应蛋白定义为发
10、生感染情况下浓度改变超过25%.一些急性时相反应蛋白的浓度会减少，但大多数会增高。,急性时相蛋白,CRP a1-酸性糖蛋白 触珠蛋白 a1-抗胰蛋白酶 铜蓝蛋白 纤维蛋白原 淀粉样蛋白A,敏感性比较,CRP 特性 正常含量低（1000 倍）半衰期短（24 h）,CRP 临床应用,炎症的诊断炎症与非炎症的鉴别炎症过程的监测疗效考核预后,CRP 参考范围,炎症 50 mg/L 重度炎症,CRP 炎症-抗生素治疗,CRP 炎症：手术后-无并发症,手术后病人CRP升高，术后7-10天CRP降至正常水平。,CRP 炎症：手术后-并发症,血清淀粉样蛋白A(SAA),免疫系统激活的一个标志物不像 CRP 一
11、样因免疫抑制物而减少反应时间短，增长变化大敏感,但不特异受以下因素影响增加急性排斥病毒或细菌感染其他炎症刺激因子反应于 IL-1,TNF-,IL-6，在肝脏合成,SAA 作为急性异体排斥反应的标志物,第一次排异发生在手术后第2天，SAA出现一个峰值。第二次排异症状出现之前，SAA又一次升高。使用抗胸腺球蛋白治疗后，排异反应得到控制，CRP变化不明显。,心血管疾病,hsCRPAPOA1APOBLPaHCY,hsCRP,心血管疾病风险因子 3 mg/L 高度风险,CRP 单独还是和其他危险因子一起做？,肌钙蛋白（Troponin）是心肌坏死的标志物 短期的预示 CRP 反映冠心病的潜在的炎症过程
12、长期的预示 CRP 和肌钙蛋白是独立的、外加的危险预测项目 对不稳定心绞痛的病人应将CRP 和肌钙蛋白 I 或 T 结合起来,CRP检测-作为初级风险评估,对门诊病人，进行血脂检查的同时应进行CRP检测在初级预防中CRP是未来心血管疾病发病的独立预测项目，可以增加血脂检查、代谢综合征等hs-CRP筛查的费用远小于其他心血管检查的费用从寿命延长和费用/效果比值这两项指标来看，hs-CRP筛查是高度有效的 美国一些临床医师已将hs-CRP检测作为每年健康体检的内容之一,CRP的预后价值：在不稳定心绞痛病人中预测存活率,一年累计存活率：,CRP 3,CRP 3,CRP升高:治疗意义,治疗性地改变生活
13、方式停止吸烟控制体重减少食物中脂肪和胆固醇含量增加体育锻炼 药物治疗 aspirin(platelet-inhibition&anti-inflammatory)statins(lipid-lowering&anti-inflammatory),肾脏疾病,肾脏疾病,目前世界上患肾病的人口已超过5亿，慢性肾病已经成为全球性公共卫生问题 美国成人流行病学调查资料显示2004 CKD 的患病率为13.1%2000年至2004年日本成人CKD患病率高达20%我国CKD流行病学调查 北京成人CKD患病率为9.4%上海成人CKD患病率为11.8%广州成人CKD患病率为10.1%我国慢性肾脏病的总患病率为9
14、.4%13.6%,肾脏疾病 CKD 的定义,美国肾脏基金会（NKF）2002年制订的慢性肾脏病临床实践指南（K/DOQI）将慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)定义如下：(1)肾脏损伤(血、尿成分异常、或影像学检查异常、或病理学检查异常)3个月，有或无肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)异常；(2)GFR60 mlmin1(1.73 m2)1 3个月，有或无肾脏损伤证据。上面两条中，有一条肯定存在即能诊断为CKD。,肾脏疾病 GFR衡量标准,阶段 GFR(ml/min)描述 1 90 正常或抬高的 GFR 260-89 轻度
15、 GFR 降低 330-59 中度 GFR 降低 415-29 重度 GFR 降低 5 15肾衰,肾脏损害的早期指标,尿微量蛋白Cystatin C,尿液中特定蛋白标记物,尿液中特定蛋白标记物,正常的尿蛋白模式,试纸条检测蛋白阴性TPU 100 mg/LAlb 20 mg/g Crea1M 14 mg/g Crea,肾小球蛋白尿,试纸条：蛋白通常阳性,但在微量蛋白尿阶段也可以为阴性TPU 100 mg/LAlb偏高20-200 mg/g Crea=微量白蛋白尿 200 mg/g Crea=白蛋白尿如果 Alb300mg/L可以使用折返功能检测IgG 1M 14 mg/g Crea,肾小管蛋白尿
16、,试纸条：蛋白通常阴性因为1M 不能用试纸条进行测定TPU 通常 14 mg/g Crea,肾小球-管性混合蛋白尿,试纸条：蛋白阳性TPU 100 mg/LAlb 20 mg/g Crea1M 14 mg/g Crea通常,在混合性蛋白尿情况下，肾小球和肾小管两种标志物都会显著增高,肾前性蛋白尿,只要不存在肾小球损伤，试纸条蛋白检测通常是阴性的。TPU 100 mg/LAlb 20 mg/g Crea根据疾病阶段而定1M 14 mg/g Crea,因为会和轻链竞争肾小管的重吸收容量在gamma病条件下-或-轻链增高,肾后性蛋白尿 肾后性血尿,试纸条蛋白 阳性 试纸条红细胞 阳性TPU 100
17、mg/LAlb 20 mg/g Crea IgG 10 mg/g Crea;IgG/Alb 0.21M 14 mg/g Crea 2M 10 mg/g Crea2M/Alb 0.02相比于小分子蛋白质而言，大分子蛋白会典型地显著增高,胱氨酸蛋白酶抑制物 C（Cystatin C）反应肾小球滤过率的敏感标志物,一种内生性非糖基化单链带正电的蛋白质 由120个氨基酸组成，分子量为13.360KD 属半胱氨酸蛋白酶抑制剂大家族内的成员之一 等电点为9.3 所有的有核细胞都能稳定地产生Cystatin C 广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中，其中包括血液、尿液、脑脊液 泪液、胸腹水、精囊液和唾液 经
18、肾小球滤过，在肾小管内全部降解,Cystatin C,Cystatin C 的参考范围,儿童,4 m,4 m-17 y,18-49 y,成年人,50-64 y,65-80 y,老年人,80 y,n=42,n=212,n=258,n=51,n=214,n=184,0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,N Latex Cystatin C(mg/L),(Box-and-Whisker 图形显示 10th、25th、50th、75th 和 90th 白分位),Price&Newman,London/UK,Cystatin C N Latex Cystatin C Reference Ranges,Cystatin C 与GFR转换,74.835 GFR预计=CysC 1/0.75 可以可靠灵敏地进行GFR的预测，没有肌酐测定的限制，所以可以推导公式,谢谢！,
