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1、项目四细胞工程制药技术,主要内容：细胞培养细胞融合、重组单克隆抗体制备与应用,模块一、必备知识 细胞工程:以细胞作为研究对象，运用细胞生物学、分子生物学等学科的原理与方法，按照人们意愿设计改造细胞某些遗传性状，从而培育出新的生物改良品种或通过细胞培养获得自然界中难以获得的珍贵产品的生物技术。,第一节 细胞培养技术细胞培养条件：1、营养 2、生长环境,（一）动物细胞培养技术,动物细胞体外培养具有明显的表达产物方面的优点，为传统的微生物发酵技术所无法替代。其中以它们转录后修饰和产物胞外分泌表达最为人们所感兴趣。,二、动物细胞培养特征 贴壁依赖性细胞 非贴壁依赖性细胞 兼性贴壁依赖性细胞,贴壁细胞
2、生长须有贴附的支持物表面,自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。两种形态：成纤维细胞型 上皮细胞型,悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国仓鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。,三、动物细胞培养技术 原代培养：是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，是检测药物很好的实验对象。,传代培养：将培养细胞从培养器中取出，把一部分移至新的培养器中再进行培养。原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯
3、竭，都将影响细胞的生长。1、有限细胞系2、连续细胞系,四、动物细胞培养的营养条件特点：1、细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素；2、动物细胞较微生物大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；3、培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌；,4、在机体中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性；5、培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵6、大规模培养时，不可套用微生物反应的经验：7、原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。,培养基组成1、天然培养基血清 水解乳蛋白 胚胎浸液等2、合成培养基氨基酸 维生素 糖 无机盐等
4、加10%-20%血清血清的优点？缺点？无血清培养基,五、环境条件1、无毒无菌2、温度 温度除直接影响到细胞生长外，与培养液的pH值也有关。如低温时可增加CO2的溶解性而影响pH。最理想的做法是把配有血清的培养液，置于36.5中。过夜，然后再用于培养。,3、渗透压人类血浆的渗透压为770kPa，小鼠类则为820 kPa。培养液的渗透压一般介于(690850)kPa之间，能为多数细胞所耐受。4、气体环境与pH,六、保存与运输保护剂：DMSO、甘油-80度或（-196度）液氮,七、动物细胞大规模培养 大规模培养动物细胞生产生物制品大约始于本世纪50年代，Earle等开发出细胞培养基之后，主要是用于生
5、产病毒疫苗。最初的生产方法是采用成百上千只体积小的培养瓶，后来又改用滚瓶培养。,1967年，Van Wezel开发了适合贴壁细胞生长的微载体，使得动物细胞的培养能够在搅拌釜式反应器中进行，大大提高了生产率。,1972年，Knazek开发了中空纤维反应器，使得细胞密度大为提高。1975年，Koholor和Milstein创立了细胞融合技术，使得悬浮细胞的培养变得十分迫切，气升式反应器被应用于杂交瘤细胞的培养，以生产单克隆抗体。,1978年，Lim还开发了细胞微囊化技术，将非贴壁依赖性细胞包含在较小的颗粒状微囊中，使培养在搅拌釜式或气升式反应器中进行，并放大至1000L规模。,模块二、操作技术,一
6、、细胞融合 细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。,2、细胞融合的意义理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。,3、融合的基本过程 细胞准备 诱导融合 杂种细胞选择 如HAT培养基 杂种细胞克隆,
7、促融剂：病毒：促使细胞融合的主要步骤如下：两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,PEG诱导:聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。,聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程,PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG
8、可能对细胞有毒害。,电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后洗涤过程、诱导过程可控性强。,杂种细胞的筛选：细胞融合后类型的几种可能性？常见选择系统：HAT培养基 抗药性选择系统 营养缺陷型选择系统,HAT培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）,次黄嘌呤
9、鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）,抗药性选择系统利用生物细胞对药物敏感性的差异筛选杂种细胞的方法称为抗药性筛选系统。营养缺陷型筛选 如果某些细胞在一些营养物的合成能力上出现缺陷，而难以在缺少这种营养成分的培养基中存活，这类变异细胞便称为这种营养的营养缺陷型细胞。,二、细胞重组（cell reconstruction）体外条件下运用一定的实验技术从活细胞中分离出各种细胞结构或组成“部件”，再把它们在不同的细胞之间重新进行装配，从而得到新的生物活性细胞。1、核移植2、细胞器移植,三、遗传物质转移主要是指基因在细胞水平上的转移与导入。1、物理方法2、化学方法
10、3、生物学方法,第三节 单克隆抗体,课前讨论：抗体是如何产生的？如何制备？一般抗体的缺陷？一、单抗定义：只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。,单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology）。,二、单抗的制备过程（另视频录像放映）,三、单抗的应用 单克隆抗体具
11、有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术。单克隆抗体技术还可用于生物活性蛋白的分离与纯化。,单抗人源化主要困难（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；（2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的；（3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。,
