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1、第三节 高效液相色谱仪,高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。,1.储液瓶（输液管入口端安装有过滤器）；2.高压输液泵；3.混合器和阻尼器；4.进样器（阀）；5.色谱柱；6.检测器；7.废液瓶；8.数据处理和控制系统,HPLC仪器结构示意图,首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,工作过程：,一、高压输液系统,高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱
2、装置和压力表 等组成。,1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。,2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。,对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。,高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。,恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。,恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，
3、恒压泵就能提供恒定的流量。,3.梯度洗脱装置,梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。,梯度洗提,梯度洗脱装置分类,一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。,二、进样系统,进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。,通常使用耐高压的六通阀进样装置
4、,其结构如图所示：,三、分离系统,色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。,柱管材料：耐腐蚀耐压内径：2.0、3.0、4.1、4.6mm长度：5、10、15、25cm等固定相：颗粒细、圆、均一、刚性强,一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱
5、内，经冲洗后，即可备用。柱温一般为室温或接近室温。,四、检测系统,检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。,在液相色谱中，有两种类型的检测器：一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。,紫外光度检测器,作用原理 依据被分析试样组分对待定波长紫外光的选择吸收性，组分浓度与吸光率的关系遵守比尔定律。,工作过程,透镜将光源射来的光束变成平行光，经过遮光板变成一
6、对细小的平行光束，分别通过测量池与参比池，然后用紫外滤片滤掉非单色光，通过双紫外光敏电阻，根据输出信号差进行检测。,特点,灵敏度高，检测浓度可达到10-9g/ml；结构简单，对温度和流速不敏感；溶剂的选用受限制。,荧光检测器,物质受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光，可用荧光检测器检测，而某些不发射荧光的物质也可通过化学衍生转变成能发射荧光德物质而得到检测。,优点：是一种选择性强、灵敏度高，比紫外检测器高23个数量级，可达pg量级或更低，可用于梯度淋洗。缺点：样品适用范围有限，定量分析的线性范围较窄(104-105)。,示差折光检测器,借连续测定流通池中溶液折射率德方法来测定试样浓度的检测器。分为偏转式和反射式两种类型。是一种通用型检测器，灵敏度可达10-7 gcm-3。缺点是对温度变化敏感，不能用于梯度淋洗。,电导检测器,是离子色谱法应用最多的检测器，依据物质在某些介质中电离后所产生电导变化来测定电离物质的含量。受温度的影响较大，需放在恒温箱中。pH7时不够灵敏。,
