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1、第十章 高效液相色谱分析(high perfomance lquid chromatography),第一节 概述第二节 基本原理第三节 固定相与流动相第四节 高效液相色谱仪第五节 定性、定量分析,第一节 高效液相色谱法概述,与经典液相色谱法比较与气相色谱法比较高效液相色谱的特点,第一节 高效液相色谱法概述,高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径15cm,长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直
2、径多在150200m范围内。即使这样，流速仍然很低(1mL/min)，分析时间仍然很长！,第一节 高效液相色谱法概述,当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（310 m）！直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。,第一节 高效液相色谱法概述,1.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分
3、析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV10-9g,荧光检测器10-11g。,高效液相色谱法与经典液相(柱)色谱法的比较,第一节 高效液相色谱法概述,2.HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。,第一节 高效液相色谱法概述,流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气
4、体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。,第一节 高效液相色谱法概述 高效液相色谱的分类,第一节 高效液相色谱法概述 高效液相色谱的应用范围和局限性,应用范围 高沸点不易挥发，受热不稳定易分解，分子量大，不同极性的有机物，生物活性物质及天然产物，化工产品及环境污染物等等。方法局限性：使用多种溶剂，成本高，且易产生污染，梯度洗脱比气相色谱的程序升温复杂 缺少通用的检测器 分析
5、具有多种沸程的石油产品，不能替代气相色谱法也不能代替中、低压液相色谱法，尤其对受压易分解的生物活性样品,第二节 基本原理 一、柱内展宽,在色谱柱内各种因素引起的色谱峰扩展叫柱内扩展。由气相色谱速率理论可知，范氏方程概括了影响柱效的各种动力学因素，将范氏方程加以修正后即可用于高效液相色谱。,第二节 基本原理 一、柱内展宽,1.涡流扩散,填充不规则因子,填充物颗粒的平均直径,第二节 基本原理 一、柱内展宽,2.纵向扩散,组分分子在流动相中的扩散系数,流动相的线速度,第二节 基本原理 一、柱内展宽,3.传质阻力(1)流动相中的传质阻力(Hm)(2)滞留流动相中的传质阻力(Hsm),第二节 基本原理
6、一、柱内展宽,(3)固定相(液)内的传质阻力(Hs)柱内各种因素所引起的色谱峰展宽与塔板高度的关系归结为:,第二节 基本原理 一、柱内展宽,上式可简写为,第二节 基本原理 一、柱内展宽,第二节 基本原理 二、柱外展宽,柱外展宽是指色谱柱外各种因素引起的色谱峰展宽。,第三节 固定相和流动相 一、固定相,1.液-固色谱固定相 液-固吸附色谱所用的固定相，多是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子多孔微球以及分子筛。如果按结构和形态可分为：,薄壳型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔
7、层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分析。全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、柱效高。特别适于复杂混合物的分离。,第三节 固定相和流动相 一、固定相,1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2m)多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层。克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。,3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者
8、为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。,2.液-液色谱固定相 液-液色谱固定相由载体与固定相构成。原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。,1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。,2）化学键合
9、固定相 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。,第三节 固定相和流动相 一、固定相,化学键合相的形成必须具备两个条件：1.载体表面应有某种活性基团;2.固定液应有能与载体表面发生化学反应的官能团。,第三节 固定相和流动相 一、固定相,通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：,第三节 固定相和流动相 一、固定相,Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使
10、酯链断裂，因此只适于 以不含水或醇的流动相。Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格式反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4 8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH28范围内对水稳定。,第三节 固定相和流动相 一、固定相,第三节 固定相和流动相 一、固定相,第三节 固定相和流动相二、流动相,与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。,理想的溶剂应有下列特性：1.与固定相不互溶 否则，造成固定相流失，使柱的保留特性变化。2.应与检测器匹配 使用UV检测器时，溶剂截止波长要小
11、于测量波长。使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；,第三节 固定相和流动相二、流动相,3.溶剂的纯度要高 否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；4.与固定相不发生化学反应 化学稳定性好；5.适宜的粘度 粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。,第三节 固定相和流动相二、流动相,流动相的选择(1)溶剂的极性(2)流动相选择的原则,第三节 固定相和流动相二、流动相,洗脱方式(1)恒组成溶剂洗脱方式(2)梯度洗脱,第三节 固定相和流动相二、流动相,在液-液分配色谱法中，按照所使用的固定相和流动相的极性差别，可分为正相色谱法和反相色谱法两类。1.正相色谱法 流动相的极性小于
12、固定相的极性时，该系统可称为正相色谱法。2.反相色谱法 流动相的极性大于固定相的极性时，该系统可称为反相色谱法。,第三节 固定相和流动相三、正相色谱与反相色谱,反相色谱法的特点：(1)柱子使用寿命长(2)流动相可灵活选择(3)应用范围特别广泛,第三节 固定相和流动相三、正相色谱与反相色谱,第四节 高效液相色谱仪,HPLC仪器包括：高压输液装置;进样系统;分离系统;检测系统;此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置,第四节 高效液相色谱仪,第四节 高效液相色谱仪 一、高压输液系统,1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔约2 m，可防止颗粒物进行泵内。2）脱气：吹氦脱气加
13、热回流法抽真空脱气法超声波脱气法在线真空脱气法,3）高压泵：对输液泵的要求:(1)应具有较高的输出压力(2)输液压力应恒定无脉动(3)流量稳定(4)流量可调范围宽且可自由调节(5)泵体耐腐蚀。,第四节 高效液相色谱仪 一、高压输液系统,输液泵种类：恒压型和恒流型 恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。,第四节 高效液相色谱仪 一、高压输液系统,恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵。每分钟往复25100
14、次，因此脉动小。,第四节 高效液相色谱仪 一、高压输液系统,4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。,第四节 高效液相色谱仪 一、高压输液系统,梯度淋洗装置,外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即HPLC的展
15、宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。,第四节 高效液相色谱仪 二、进样系统,进样装置包括两种:1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，,第四节 高效液相色谱仪 二、进样系统,高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。,第四节 高效液相色谱仪 二、进样系统,柱材料及规格：常用内壁抛光的不锈钢管。一般为直管，标准填充柱为内径4.6mm或3.9mm,长1050 cm。柱连接方式：柱接头通过
16、滤片于色谱柱连接。柱填充方式：干法、湿法,第四节 高效液相色谱仪 三、色谱柱,1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为1530cm，内径为45mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：,第四节 高效液相色谱仪 三、色谱柱,平衡密度法：即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、THF等。,第四节 高效液相色谱仪 三、色谱柱,填充方法：填充时，按上
17、述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。,第四节 高效液相色谱仪 三、色谱柱,按检测对象分类整体性质检测器：折光指数检测器（RID），电导检测器（CD）溶质性质检测器：紫外吸收检测器（UVD）、荧光检测器（FLD）按适用性分类选择性检测器：对不同组成物质响应差别极大，如UVD、FLD、CD通用型检测器：对大多数物质响应相差不大，如RID。,第四节 高效液相色谱仪 四、检测器,液相色谱检测器包括:紫外吸收检测(UVD)器、荧光检测器(FLD)、示差折光检测
18、器(RID)电化学检测器等。,第四节 高效液相色谱仪 四、检测器,紫外检测器 其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为110 L。HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。,第四节 高效液相色谱仪 四、检测器,应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用
19、波长。,第四节 高效液相色谱仪 四、检测器,快速扫描光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图0,光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,光电二极管阵列检测器,荧光检测器,许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高23个数量级。,高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不
20、同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。,示差折光检测器,示差折光检测器,电导检测器,电导检测器 电导检测器主要用于离子色谱的检测。其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH7时，该检测器不够灵敏。,第五节 应用与示例 一、分离分析方法的选择,应用高效液相色谱法对试样进行分离、分析的第一步，是根
21、据试样的特性来选择一种最合适的分离类型。色谱分离类型主要是根据试样分子量大小、溶解度参数和分子结构等化学性质和物理性质来选定。,应用 由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象,在生物化学和生物工程中的应用,氨基酸、多肽和蛋白质的分析核碱和核苷、核苷酸、核酸的分析紫外检测器生物胺的分析：研究生物胺及代谢产物与人体健康和疾病研究有重
22、要意义柱前或柱后荧光衍生化法,在医药研究中的应用,合成药物的纯化及成分的定性、定量分析，中草药有效成分的分离、制备及纯度鉴定，人体血液及体液中药物浓度、药物代谢物的测定，手性药物中对映体含量测定及拆分等。,在食品分析中的应用,糖类的分离分析有机酸及酸味剂的分离分析维生素的分离分析食品添加剂的分离分析：防腐剂，抗氧化剂，甜味剂和香料，人工合成色素，食品污染物分析。,在环境污染分析中的应用,农药残留的检测酚类和胺类的检测多环芳烃的检测多氯联苯的检测,习题,9.用长15cm 的ODS 柱分离二个组分，已知在实验条件下柱效n=2.84 104m-1。用苯磺酸钠溶液测得死时间tM=1.31min，二个组分的保留时间分别为tR1=4.10min 及 tR2=4.38min。（1）求k1，k2，R。（2）若增加柱长至30cm，分离度可否达到1.5？,习题,解：,习题,(2)已知,习题,10.在某一柱上分离一样品，得以下数据。组分A、B 及非滞留组分 C 的保留时间分别为2min、5min 和1min。求（1）B 组分停留在固定相中的时间是A组分的几倍？（2）B组分的分配系数是A 组分的几倍？（3）当柱长增加一倍时，峰宽增加多少倍？,习题,解：,习题,
