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1、临床微生物学检验在感染诊治中的作用,1,2,3,4,Click to edit Master title style,Click to edit Master subtitle style,主要议题：微生物室的概况耐药监测，帮助医生经验选药规范标本采集及常见标本类型的案例分享临床与微生物检验中常见问题的讨论,6,内容提要,一.微生物室的概况,实验室面积：70+m2（标本接收室、接种室、仪器操作间、培养基制备间、资料库房）人员：共3人，1-2人/天主要仪器设备：德灵 Microscan Walk/Away-40全自动微生物鉴定和药敏试验分析系统BD公司BACTEC 9120 全自动血培养系统AT
2、B半自动细菌鉴定和药敏分析系统（ATB-STREP 5、ATB-HAEMO）,7,8,一.微生物室的概况,现今的微生物实验室大体分为三大部分：传统微生物检测技术（涂片、培养、鉴定和药敏）非传统微生物检测技术（免疫学方法）分子生物学检测技术（基因测序、耐药基因检测等）,9,一.微生物室的概况,基于涂片染色+镜检的微生物检查是微生物检验中古老但非常有效的方法。,显微镜镜检不仅可以迅速了解标本中有无病原体，而且可根据其形态和着色性进行初步分类，为临床经验用药提供依据。,涂片检查结果对临床早期诊断和治疗有十分重要的意义。,培养,有效，快速容易漏检,根据标本的种类和培养目的来选择不同的培养方法，如常规C
3、O2培养，尿液定量培养方法，多重耐药菌需选择性培养基，以及厌氧培养等。,最有效慢速,涂片,流行病学资料,指导本院的临床用药,预测耐药发展趋势,有目的的科研方向,经验诊断中的依据,经验诊断与用药经验,一.微生物室的概况,直接镜检法和培养检查法是形态学检查的基本方法，我们不应该轻视形态学，特别是“镜检”、而片面的去追求一些尚不成熟的“新技术”。,11,一.微生物室的概况,强调一下，镜检及培养的重要临床意义：,直接镜检简单、快速、实用1.评价送检标本质量2.对临床快诊快报3.评价培养质量4.对培养物鉴定药敏有导航的作用5.简单、常规的工作却需要经验的积累和责任心.6.但阳性率较低，阴性结果不能排除诊
4、断,12,一.微生物室的概况,镜检及培养的重要临床意义：,培养作为直接涂片的后续步骤，其目的是为了：进一步提高对病原体检出的阳性率验证直接镜检的结果同时确定致病菌的种类但所需时间较长,必须强调直接镜检与培养检查相结合的重要性！,13,必须强调直接镜检与培养检查相结合的重要性！,涂片和培养二者相辅相成缺一不可！,14,内容提要,主要议题：微生物室的概况耐药监测，帮助医生经验选药规范标本采集及常见标本类型的案例分享临床与微生物检验中常见问题的讨论,病原谱,抗菌药物选择的决定性因素之一,15,社区获得性感染常见类型CAPAECOPDUTI皮肤软组织感染,医院感染常见类型 HAP BSI CAUTI
5、SSI(含腹腔感染、术后脑膜炎),医生需要什么样的病原谱信息呢？,16,这样的信息对临床治疗决策有意义吗？,针对性病原谱信息对临床决策有价值,17,MRSA（耐甲氧西林的金葡）占金葡中87.8%,抗菌药物敏感性监测数据,现有大量的抗菌药物敏感性监测数据国家层面：CHINET、全国细菌耐药监测网（CARSS）地区层面：多家医院数据汇总医院层面：微生物提供的全院数据科室层面：微生物提供的重点科室（如ICU、感染科、呼吸科）的分科室数据,18,目前抗菌药物敏感性监测数据的利与弊,利：有助于制定抗菌药物管理政策（如限制某些药物使用）有助于确定感控中监测的目标菌（如CRE、VRE）,弊菌株的临床意义不明
6、（可能是感染、定植和污染）质控较差（含有大量痰、分泌物等低质量的标本）未能按感染类型分类使用抗菌药物后耐药菌易分离,19,目前的敏感性监测数据对个体治疗决策的帮助小，临床需要的不是大而全的监测数据，而是结果疾病谱的耐药性监测数据：,20,社区获得性感染：地区数据CAPAECOPDUTI皮肤软组织感染,医院感染：本院数据 HAP BSI CAUTI SSI(含腹腔感染、术后脑膜炎),21,内容提要,主要议题：微生物室的概况耐药监测，帮助医生经验选药规范标本采集及常见标本类型的案例分享临床与微生物检验中常见问题的讨论,规范微生物标本采集,22,微生物检查的标本收集原则,无菌采集无菌容器及时足量迅速
7、送检,23,及时运送,苛养菌中除卡他莫拉菌外，流感嗜血杆菌和肺炎链球菌对干燥、寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体后其存活率十分低。对环境抵抗强的细菌（铜绿假单胞及其他G阴性菌、葡萄球菌、念珠菌等）2-4h繁殖数代，影响定量结果。,24,送检标本种类与临床意义,临床意义较低的标本：痰、咽拭子（HI、SP、A链、溶血隐秘杆菌除外）粪便、肛拭子（致腹泻病原菌和艰难梭菌CD）临床意义中等的标本：尿 脓液、伤口分泌物临床意义较大的标本：血、CSF、胸腹水、及其他无菌体液,25,常见标本类型的案例分享,26,常见标本类型的案例分享,CASE1：2015/11/25 病人：男性 感染科-082床 肺吸虫病
8、标本：痰.CD4T淋巴细胞：1/ulESR：78mmCRP：107mg/LPCT：0.88ug/L,27,28,在合格的痰标本里发现“有隔菌丝”，是比较有临床意义的！于是把痰标本接种了SDA、血平板。2天后血平板优势生长出了丝状真菌。,29,2天的血平板棉兰染色，显微镜观察如下图：,因镜下形态曲霉特征明显，但单纯靠血平板和目前所观察到的镜下形态难以鉴定为啥曲霉？随后进行了PDA的转种。,30,PDA平板四天时的菌落和镜下形态如下图：,根据菌落和镜下特点，倾向于土曲霉，但菌落颜色因时间的关系，仍不够典型，续孵。,31,PDA平板六天时的菌落形态如下图：,典型的泥土色菌落出现，确定为“土曲霉菌”。
9、,CASE2：肾病科 药物毒性反应 男 编号：1779和1780 连续两次抗酸染色,32,10%NAOH消化痰液后低速离心镜检,33,10%NAOH消化痰液后低速离心镜检,镜下发现的菌丝进行革兰染色 如上图,把两个标本都进行了真菌培养，接种了血平板。,血平板培养48h后，菌落如下：,从平板中可以看出两者是几乎是一样的丝状真菌生长，于是都分别转种了SDA平板。,34,1779 48h,35,转种SDA后4d的生长情况,1779 号,1780 号,36,1779 号,当即做了棉兰染色，如上图,烟曲霉菌,简单、常规的工作却需要经验的积累和责任心.,37,38,曲霉菌属,曲霉是一类丝状真菌，自然界中广
10、泛存在。常可以再泥土、植物腐物、空气中等处分离到。其引起的人类疾病可分为机会性感染、变态反应性曲霉病及曲霉毒素中毒。免疫受损是曲霉机会性感染最常见的原因。感染可以表现为局限性的曲霉球到严重的侵袭性感染。,39,与侵袭性曲霉病发病相关的主要危险因素有：,中性粒细胞及巨噬细胞数量减少或功能异常；骨髓造血干细胞及实体器官移植、肿瘤放化疗、COPD、ICU机械通气以及长期使用糖皮质激素、细胞毒药物等免疫功能受损的患者。,检验结果的解释：,曲霉菌为条件致病菌，自然界粪便广泛，某些菌可以成为实验室污染菌。因此曲霉菌分离结果需要谨慎对待。结合镜检结果判断培养得到的曲霉是否具有临床意义，一般来说以下几种形式被
11、认为具有临床意义：1.无菌部位或下呼吸道临床标本中发现菌丝；2.单一标本中为优势菌或者多次标本中分离得到同一菌株；3.组织中发现菌丝。注意：当怀疑肺部真菌感染的时候，最好连续培养三次痰标本。痰液中分离出的曲霉菌则应结合直接镜检结果进行考虑，涂片细胞学检查为合格的痰标本，且初始分离培养基上呈优势生长可作为临床诊断的依据。,41,CASE 3:,2015.12.27 上午10点，患者:张某“反复腰背疼痛半月，加重伴起卧困难3天”入院。入院前半月，患者无明显诱因开始出现腰背部疼痛，间歇性疼痛，持续时间长短不一，休息后可缓解。既往康健，无不良个人史。辅助检查：MRI显示腰4/5椎间盘突出，腰4椎体失稳
12、，腰椎侧凸畸形。血常规：正常，ESR：31mm/h 27日下午14时，反复高热，最高达39.7，送检血培养28日心内科、感染科会诊：发热待诊。感染性心内膜炎可能性小，不排除血流感染，建议进一步检查。29日彩超：双侧腋窝查见淋巴结（结构异常）。血PCT：0.43ng/ml HS-CRP：39.18mg/L。30日，血液科会诊，发热待诊，原因不明，转入血液科，行骨髓穿刺送检，结果正常。,诊断陷入纠结，发热原因何在？感染？非感染？,接收了血培养的微生物室呢？,42,1.1下午发现仪器报阳（+）进行了常规涂片和转种，但涂片革兰染色：未见细菌。1.2转种平板未见明显生长。思考？,1.血培养瓶4-5天报阳
13、，假阳性？真阳性？2.革兰染色未见细菌是真的无菌吗？3.骨科病人，有骨骼和关节损伤可能。4.血平板24h未见明显生长，是生长缓慢？还是真的也无菌生长？,生长曲线,43,108.96h报阳，4.5d，明显的倒S行，符合真阳性表现。,真阳性！,报阳瓶再次涂片革兰染色,44,查见可疑“细菌团”。,45,报阳瓶再次涂片瑞氏染色,清晰可见“沙堆状”紫色细菌团。,再次转种的普通巧克力平板,46,布鲁氏菌属触酶：阳性氧化酶：阳性吲哚试验：阴性有上述生化反应特征且2h内脲酶阳性的微生物应被推定为布鲁氏菌种!并应立即采取生物恐怖预防措施！,布鲁菌-人畜共患病原菌,47,布鲁菌容易感染猪、羊、牛等家畜，人类与病畜
14、接触或食用病畜肉、奶及奶制品而被感染。Brucellosis,布病：也称“波状热”“马耳他热”或“地中海池张热”，是布鲁菌引起的急性或慢性传染病，属于自然源性疾病，主要表现为：发热、多汗、乏力、关节痛可逐渐转为慢性，侵袭骨骼系统、中枢神经系统、呼吸道、胃肠道、心血管系统和皮肤。,血培养是重要手段！,48,内容提要,主要议题：微生物室的概况耐药监测，帮助医生经验选药规范标本采集及常见标本类型的案例分享临床与微生物检验中常见问题的讨论,一、涂片镜检结果与培养结果不吻合？,1、涂片结果是报告所有检见病原菌，而培养的目的是检出致病菌，因此会产生不一致的情况；2、一些苛养菌需要在特殊环境或培养基上生长，
15、因此常规培养不一定能得到结果。,临床与微生物检验中常见问题的讨论,取的明显是脓液标本，为何培养报告为无菌生长？,1、常规培养为需氧培养，脓液可能来自厌氧菌感染；2、病原菌可能被大量的中性粒细胞吞噬。,二、,未破裂脓肿：消毒覆于脓肿表面的皮肤，用注射器将脓肿内容物吸出，注射器针头扎入无菌橡胶瓶盖（青霉素小瓶橡胶塞）。-厌氧培养or需氧培养,开放病灶和脓肿：不建议做厌氧培养；用无菌生理盐水或70%酒精擦拭除去表面分泌物，尽量去除表面菌群，用拭子采集病灶底部或边缘的标本，置于需氧培养基中。-需氧培养,临床与微生物检验中常见问题的讨论,三、一般培养三天出结果，为何第四天还没有结果？,常规流程：将标本接
16、种于不同的培养基，在培养箱中进行培养，24h后观察培养皿中生长情况，此时若无病原菌生长，继续放回培养箱中培养24h，若任无细菌生长则判定为阴性结果，因此常规培养报告时间为3天。第四天出报告：,临床与微生物检验中常见问题的讨论,四、今天的培养结果与前一天的不一样？,1、取材是否一致；2、痰标本，选择优势菌做鉴定药敏，就可能导致两次结果不一致。,痰标本中：铜绿、金葡肠杆菌（肺克）鲍曼,痰中常见的定植菌或污染菌念珠菌（如果没有其他部位培养阳性）嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌凝固酶阴性葡萄球菌弗劳地柠檬酸菌（枸橼酸菌）和阴沟肠杆肠球菌木糖氧化产碱杆菌,临床与微生物检验中常见问题的讨论,五、明显是稀
17、便，培养结果为何正常？,大便培养，通常只能鉴定志贺菌、沙门菌感染，很少医院常备致病性大肠杆菌鉴定血清，很少医院能够做艰难梭菌培养，很少医院能常备霍乱弧菌血清。,与国际微生物检验的差距-缺项1.艰难梭菌：医院感染常见病原菌，一些发达国家中排名第一2.肺炎链球菌3.军团菌4.非典型分支杆菌5.呼吸道感染病毒,临床与微生物检验中常见问题的讨论,六、培养报告上写着四联球菌、类白喉棒状杆菌，为何没有药敏结果？,1、四联球菌为微球菌、类白喉棒状杆菌，一般不引起人体致病，为非致病菌，故考虑污染可能；2、药敏结果需参照CLSI标准，目前微球菌没有参照标准，故暂不能做药敏试验，若需治疗可参照阳性球菌用药。,“若
18、仅从一份血培养中分离出凝固酶阴性葡萄球菌，不必常规做药敏试验，因为这种菌经常认为是血培养中的皮肤污染，假如需要做药敏，请在24小时内联系实验室。”,需氧瓶,厌氧瓶,血培养送检要求:2-3套8-10ml/瓶,儿童除外,临床与微生物检验中常见问题的讨论,培养阳性的病原菌都需要用抗菌药物治疗吗？,1、不是；2、培养阳性感染，可能为污染（血培养），可能为定植（痰培养）；3、任何结果必须结合临床情况进行评价（重要）；4、感染部位的清创、引流、换药比使用抗菌药更重要；5、改善患者全身情况：器官功能支持、纠正酸碱平衡、电解质紊乱、低蛋白血症、高血糖等。,七、,临床与微生物检验中常见问题的讨论,临床想用的药物
19、在药敏试验中没有做？,1、可能是天然耐药2、可能是药敏板没有包括该药3、可能是该药敏感性被其他药物所预报,是否能将所用的药物都做抗菌药物敏感试验？,1、没有必要：通过耐药机制和标志性药物可以预测其他药物的敏感性。2、没有可能：药敏药物需要在体外稳定，需要有操作标准和解释标准。,八、,九、,临床与微生物检验中常见问题的讨论,天然耐药：肠球菌：对除青、氨苄以外的所有青霉素类、头孢菌素类天然耐药。肺炎链球菌：对氨基糖苷类天然耐药。嗜麦芽窄食单胞菌：碳青霉烯类天然耐药。肺炎克雷伯菌：对氨苄西林天然耐药。阴沟肠杆菌、产气肠杆菌：对头孢西丁天然耐药。铜绿假单胞菌：对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、
20、复方新诺明、1、2代头孢天然耐药。对三代头孢（噻肟、曲松）即使药敏试验敏感，在实际里程治疗中也需要超大剂量才会取得疗效。头孢中仅他啶和吡肟。铜绿假单胞菌有对跟多药物的诱导耐药性，在体外试验可能没有表现出来，但一旦接触某种抗生素，其沉默的耐药基因可能被诱导激活，耐药性则表现出来，这种特性在-内酰胺抗生素中尤为明显，可导致体外敏感，但实际治疗却无效。,临床与微生物检验中常见问题的讨论,耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌发生率,耐碳青霉烯类用量,对碳青霉烯类耐药或中介敏感铜绿假单胞菌比例(%),碳青霉烯类用量(DDD/1000床-日),中部地区,西南地区,东部地区,碳青霉烯的用量与碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌的检
21、出率正相关，r=0.63，P0.01,Plss-Suard C,et al.Antimicrob Agents Chemother.2013;57(4)：1709-13.,临床与微生物检验中常见问题的讨论,临床想用的药物在药敏试验中没有做？,1、可能是天然耐药2、可能是药敏板没有包括该药3、可能是该药敏感性被其他药物所预报,是否能将所用的药物都做抗菌药物敏感试验？,1、没有必要：通过耐药机制和标志性药物可以预测其他药物的敏感性。2、没有可能：药敏药物需要在体外稳定，需要有操作标准和解释标准。,临床与微生物检验中常见问题的讨论,A组：常规报告组，常规试验并常规报告的药物；B组：选择性报告组，临床
22、上重要，针对院内感染控制，可用于常规试验，选 择性报告药物；C组：补充报告组，替代性的补充性的药物，在A/B组过敏或耐药时选用；U组：仅用于治疗泌尿道感染的药物,临床与微生物检验中常见问题的讨论,新药往往没有列入药敏谱首选，新药由于刚刚在临床使用，还没有列入CLSI监测范畴，也没有足够数据，因此没有依据加以判断。,药敏谱中各类各代抗生素都有一定代表性，如喹喏酮二代的环丙沙星在药敏试验中敏感，那么对于三代的左氧氟沙星、司帕沙星等临床医生可根据需要加以选择。,“CLSI M100-S24：对于肠球菌属细菌/对于肠杆菌科细菌氨苄西林的敏感性试验结果可用于预测阿莫西林的活性。阿莫西林敏感性可用于预测亚胺培南的敏感性，但仅限粪肠球菌。”,临床与微生物检验中常见问题的讨论,为什么有的菌报告很多药物，有的仅报告几种药物？,报告的药物种类根据细菌种类的不同而不同，如鲍曼不动杆菌报告的药物较多，而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药敏较少。,十、,临床与微生物检验中常见问题的讨论,*=仅用MIC实验；纸片扩散法不可靠,临床微生物室在感染病学中的角色,以多种检验手段，提供准确、及时、个体化的病原学证据；和临床医生共同解读病原体报告；提供有意义的、可靠的临床流行病学监测资料；开展以院内感染控制为目的的筛查项目；参与感染诊治的教育培训工作；,65,Thanks for your attention!,
