分离科学与进展专题.ppt

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1、分离科学与进展 专题(二)色谱分析新技术,杨俊,讲座内容,色谱与质谱联用技术,多维色谱技术,亲水作用色谱技术,超高压液相色谱技术,一、超高压液相色谱技术,最近10年，在液相色谱分离领域快速发展几项技术：1、超高压液相色谱技术；2、亲水作用色谱技术；3、高温液相色谱技术；4、整体柱技术。,(Trends in Anal.Chem.29:15；J.Sep.Sci.33,679),1964年,Giddings指出最大理论塔板数和分离速度与色谱系统的操作压力有关,并提出增高色谱柱压力改善分离度的方法。1969 年,Bidlingmeyer等第一次使用亚2m 填料填充的色谱柱进行研究,实验结果重复性较差

2、。1974年,Guiochon等对使用超高压的液相色谱行为进行了理论研究,提出压力对分离的影响规律。1997年,MacNair使用粒径1.5m 无孔填料填充了52 cm 30m 的毛细管柱,使用压力410MPa,获得最高柱效为30万块塔板/m。这一实验结果被认为对超高压液相色谱的发展具有里程碑的意义。(Anal.Chem.,1997,69:983)2003年,Jerkovich等填充了填料粒径为1.0m的色谱柱,最高柱压达到700 MPa,等度分离5 种组分仅用了8m in,分析时间大大缩短。使用37 cm 30m 的色谱柱分离邻苯二酚和对苯二酚,柱效分别达到50万塔板/m 和62.5万块塔板

3、/m。Waters 公司在2004年首先推出了AcquityUPLC系统,其采用小颗粒填料,在高压下运行。商品化的超高压液相色谱仪器的序幕由此揭开。基于同样原理,Thermo公司和Jasco公司也相继推出了耐压104MPa的液相色谱系统。而Agilent和岛津公司则通过升高温度来降低柱压,系统压力60MPa。,超高压液相色谱的历史回顾,使用亚 2m填料,色谱柱的孔隙率低,在相同流速下产生的压力大,因此产生了超高压液相色谱(ultrahigh pressure liquid chromatography,UHPLC)。超高压液相色谱的使用压力一般超过40MPa。有人把使用压力在100 MPa以上

4、的才称为UHPLC,而使用压力在40 100 MPa之间的称之为UPLC,即超高效液相色谱。UPLC 原理：UPLC 保持了传统HPLC 的基本原理，但其分离效能和分析速度得到了全面提升，这归功于其独特的小颗粒色谱填料技术。在HPLC 的速率理论中，Van Deemter 方程可简化为:H=A+B/v+C v其中:H 为理论塔板高度;v 为流动相的平均线速度;A、B、C 为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数和传质阻力项系数，其中各项均与固定相粒度(dp)相关，如仅考虑dp 对H 的影响，上式可表示为:H=a(dp)+b/v+c(dp)dp 是影响色谱柱性能最重要的因素。根据Knox

5、理论曲线，在相同线速度下，填料粒径越小，理论塔板高度越小，柱效越高。小颗粒填料的另一个重要特征是，当增加流量(线速度)时塔板高度没有明显的增大，且维持在一定范围内，即在较大流量范围内保持较高的柱效。,超高压液相色谱的原理,(J.Chromatogr.A,1127:60）,不同粒径柱填料的Van Deemter曲线,(J.Liquid Chromatogr.Related Tech.2005,28:1253),UPLC的性能优势,使用亚二微米填料为分离介质，使用UPLC获得小颗粒填料的性能优势：即速度、分离度和灵敏度优势。1）提高分析速度,UPLC提高分离度,2）提高分离度 根据等度液相色谱分离

6、度(R)方程,R 受n(理论塔板数)、选择因子()和容量因子(k)的控制。随着dp的减小,n 增加,则R 也增加。,UPLC提高检测灵敏度,3）提高检测灵敏度 UPLC 通过减小dp,有效地降低了H,使色谱峰变得更窄,信噪比增大,灵敏度得到额外的提高。,UPLC提高分析效率、减少流动相用量,4）分析效率、减少流动相用量 UPLC 通过分析时间短，减少流动相用量；分离度提高，单位时间峰容量增加，分析效率显著提高。,UPLC高压力带来仪器技术的改进 据Darcy 公式,流动相通过色谱柱后其压力的升高程度(P)与流动相黏度()、柱长(l)及流动相线速度(v)成正比,而与比渗透系数(k0)及d2p 成

7、反比。所以随着dp 的减小,压力将成倍地增加,因此超高的工作压力成为UPLC 的必然选择。进样系统：密封要良好还要有较小的死体积,同时要保证塞型进样,以减小峰展宽。检测器：提高采样频率之外,还需要降低噪声,减小流通池体积,采用无光损耗的检测池等技术,以保持高柱效和高灵敏度。研究发现,操作压力在140MPa以下,采样频率采用10 Hz;140 MPa以上,采样频率采用20 Hz,才能满足拟合要求。飞行时间质谱(TOF-MS)检测器的采样频率较高(100spectra/s),适合于超高压系统。梯度混合器：超高压系统中,流动相混合比例变化较快。一方面,应“足够大”,以保证在电磁阀有限的开关时间内将两

8、溶剂充分混合;另一方面,应“足够小”,以保证在恒定流速下溶剂组成的快速改变,梯度延迟体积要小。,(Anal.Chim.Acta,2009,656,8),UPLC的应用示例,超高压液相色谱(UPLC)串联四极杆质谱测定二甲双胍的血药浓度盐酸二甲双胍为常用口服降血糖药，二甲双胍主要由小肠吸收，口服0.5g，2小时后，血浆浓度达峰值，约2g/mL。二甲双胍结构稳定，血浆半衰期为1.74.5小时，12小时内以原形随尿液排出90%。三重串联四极杆质谱，具有独特的高选择性，可以显著降低复杂基质的背景干扰，从而提高检测灵敏度。超高压液相色谱具有的高分离效能，与质谱联机时，可有效减少样品基质的干扰，提高电喷雾

9、离子化效率，良好的色谱分离，可有效防止基质对待测组分离子化的抑止作用。,常规HPLC/MS/MS，对二甲双胍的检测限可达0.83pg（绝对柱上样品量）；而采用UPLC/MS/SIM,检测限可达0.14pg（绝对柱上样品量），检测灵敏度提高了6倍。在获得更好的检测结果的同时，分析时间缩短3倍。,二、亲水作用色谱技术,亲水作用色谱定义亲水作用色谱(HILIC)作为一种分离极性化合物的液相色谱模式,其概念最早是由Alpert于1990 年提出的。HILIC的主要特征是使用类似于正相色谱的极性固定相和水/有机溶剂(通常是乙腈)流动相。1970年代,Linden等就使用氨基硅胶作为固定相、以含75%乙腈

10、的水溶液作为流动相用于糖的分离分析。这种分离技术是典型的HILIC 模式,也是最早的关于HILIC 的报道,虽然其中并未涉及HILIC的定义。反相液相色谱(RPLC)是当前分离分析和分离制备中应用最为广泛的色谱模式,其依靠疏水固定相与溶质之间的疏水相互作用实现弱极性和中等极性化合物的高效分离。但是,RPLC对强极性化合物(如寡糖、糖苷和强极性寡肽等)的保留很弱,甚至不保留,不能得到很好的分离。用来分离强极性化合物的液相色谱方法主要有离子交换色谱法(IEC)、正相色谱法(NPLC)和亲水作用色谱法(HILIC)。它们可以作为RPLC的补充用于强极性化合物的分离;然而,它们又各自存在一定的局限性。

11、与正相色谱类似,在HILIC模式下化合物的保留时间随化合物极性的增强而增加。但是,由于HILIC 使用含水流动相,这就可以解决正相色谱中水溶性物质不溶于流动相的问题。,(J.Chromatogr.,1990,499:177;J.Chromatogr.,1975,105(1):125;),HILIC模式对强极性化合物和亲水化合物具有很好的保留和分离选择性,是解决各类强极性化合物和亲水化合物分离问题的可靠手段。HILIC模式使用的流动相体系相对简单,操作方便,而且克服了NPLC的流动相对水溶性物质溶解性差、保留时间对流动相中水含量敏感以及与质谱检测器不兼容等缺点。HILIC 的分离机理与RPLC完

12、全不同,两者的分离选择性有很好的正交性,而两者的流动相体系却相似,十分适合用于构建HILIC-RPLC二维色谱系统。近年来,HILIC 越来越受到关注和重视。主要是因为强极性化合物的分离问题引起了各个研究领域的重视,如药物分析、代谢组学、蛋白质组学等研究领域都不同程度地涉及强极性化合物的分离问题。,(Anal.,Chem.,2005,77:6426),亲水作用色谱的优势,根据Alpert 对HILIC的定义,极性样品在HILIC中的保留基于分配机理。研究表明,当使用水-水溶性有机溶剂作流动相时,亲水性的固定相表面会固着一层富水层;而一些糖类化合物在氨基衍生的硅胶固定相上的保留也确实包含分配机理

13、。Alpert同时指出:导致两相之间发生分配的原因并不清楚,有可能也包含了某些偶极-偶极相互作用。在后续的研究中,有人提出保留是基于溶质在固定相上的吸附。更多的实验现象则表明HILIC 的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应。HILIC的分离机理在目前还存在着争议,但在实际应用中,普遍认为其保留行为受到多种参数的影响,如固定相的功能基团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH 值、缓冲盐的种类和浓度等。,(化学进展,2006,11:1508;J.Sep.Sci.2006,29,1784),亲水作用色谱的分离机理,传统的NPLC固定相直接用于H ILIC NPLC使

14、用的极性固定相主要有纯硅胶、氨基键合相、氰基键合相和二醇基键合相等。这些固定相具有较强的极性和亲水性,都能直接用于HILIC。传统的正相色谱固定相虽然可直接用于HILIC模式,但是在亲水性、选择性、重复性和使用寿命方面存在很多问题,其应用范围有限,不是理想的HILIC固定相。,亲水作用色谱的固定相,由于HILIC 模式的快速发展和强极性化合物分离需求的增强,专为HILIC设计的固定相得到了越来越多的关注和应用。已经有多种类型的专门用于HILIC 的固定相实现了商品化，根据键合相的化学结构进行分类,HILIC固定相可分为酰胺型、多元醇羟基型和两性离子型等。这几类基团具有很好的亲水性,十分适合作为

15、亲水色谱的固定相,而且在一定程度上可以解决传统正相固定相用于HILIC 所存在的问题。,(色谱.2009,27,675),为亲水作用色谱设计的固定相,以葡萄糖和麦芽糖为功能基团的糖基固定相中的醇羟基分布在自由的糖单元上,结构上具有独特之处。用于分离单糖、二糖、糖醇、寡糖、碱基、核苷、肽以及中药中的强极性组分。离子型固定相具有很好的亲水性,因此也可以应用于HILIC 模式.,(Chem.Commum.,2007,24,2491),糖基固定相和强离子交换固定相,色谱柱效高,峰形对称,保留时间短。流动相组成简单,固定相稳定。有利于样品制备：样品制备如固相萃取(SPE)、蛋白沉淀(PP)或液-液萃取(

16、LLE)中,其最后一步常含强有机溶剂(如乙腈、异丙醇等)。这些溶剂太强,无法直接注入反相色谱柱,它们必需蒸干再溶于与反相条件相适的弱溶剂中。这一费力又费时的步骤可占到样品处理所需全部时间的50%。提高电喷雾质谱(ESI-MS)的灵敏度,有利于蛋白质组学、代谢组学、环境科学和食品安全等领域的分析研究。亲水作用色谱的发展趋势:降低柱粒径(超高压)、整体柱、二维色谱和高温色谱。,(化学进展,2006,11:1508),亲水作用色谱的特点,一种聚甲基丙烯酸酯类亲水作用毛细管电色谱整体柱的制备与评价以2-羟基乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)为单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂,制备亲水分离模式的

17、新型毛细管电色谱整体柱。整体柱(Monolithic column)又称整体固定相、棒柱、连续床层无塞柱，由Hjerten 研究组于1989 年首次提出。与传统的填充柱分离材料相比，整体柱兼具高效液相色谱多孔填料的高容量和快速分离的优点，具有分辨率高、制备成本低、使用寿命长、稳定性好等优势，因此被誉为继多聚糖、交联与涂渍、单分散之后的第4 代色谱填料。亲水作用色谱采用极性较强的固定相和有机溶剂含量较高的含水流动相;固定相可有效保留极性物质。4 种碱基在聚毛细管整体柱上得到很好的分离。4种碱基按照极性由小到大(尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤)顺序出峰。,(J Chromatogr:A,1989,

18、473:273;色谱,2010,28:1173),亲水作用色谱的应用-示例,高温液相色谱技术,历史回顾:20 世纪80 年代后期，高温液相色谱（HTLC）技术得到许多研究者的重视。1987年，Warren 实验研究了温度对反相液相色谱柱效的影响。1988 年，Horvath 等通过对HPLC 分离过程中溶质输运特征的理论分析，认为提高色谱柱的柱温是提高其分离能力的有效途径。1989 年，Biggs 等采用室温到130的程序升温方法分析了聚甲基硅氧烷和烷基苯磺酸等样。1991 年，Lacasse 等在125用反相柱分离了脂肪酸苯甲酰甲酯，在145用硅胶柱分离了非离子表面活性剂。,固定相的选择:固

19、定相的稳定性是限制高温液相色谱发展的一个重要因素。随着色谱技术的发展，现在出现了几种适用于高温分析的固定相，常用的有硅胶基质固定相、金属氧化物固定相、石墨化炭固定相和多孔聚合物固定相。检测器的选择:在HTLC 系统中，随着温度的升高，流动相的性质有了许多变化，甚至可以用100%的水作为流动相，这使得更多的检测模式可以用于高效液相色谱，其中用的比较多的是紫外-可见检测器、氢火焰离子检测器和蒸发光散射检测器。,Anal.Chem.,74:1017;HC&GC,4:27,三、多维色谱技术,多维色谱的概念(multidimensional gas chromatograph,MDGC)在色谱分析中，一

20、旦遇到难分离的物质对，改变固定相的选择性是首先考虑的因素。对于高度复杂混合物，体系中可能包含不同沸点和不同极性的化合物，更换色谱柱，其中的部分物质分离效果得到改善后，其他物质的分离效果可能变差。所以，要改善总体分离效果，应采用多维气相色谱。多维气相色谱的早期开拓者-阿拉巴马州立大学的Bertsch教授1987年对MDGC的定义是:两根独立控制且极性不同的色谱柱,通过一定的切换手段，将第一根色谱柱的馏分选择性地转移到第二根色谱柱进行二次分离,从而获得比单柱更强大的分离能力的分离系统。,(Anal.Chem.2011,83,5190;Trends in Anal.Chem.,2006.25：438

21、),多维气相色谱的操作原理。一维色谱的某些馏份(tl和t2)，选择性地转移到二维柱，依靠两柱选择性的差异和峰容量的提高，使切割的成分获得更充分的分离。GC+GC和 GCGC。其它：LCLC,LC GC,LCCE,CECE,GCGCGC,LCGCGC,LCLCCE。,(J Chromatogr:A,1999,856:331),多维色谱的核心技术是接口技术,GC+GC技术,二（多）维气相色谱传统的多维气相色谱(MDGC)指的是中心切割方式，每次进样将一维柱的一段或几段馏分转移到二维柱，预柱的大部分成分通过限流管放空，造成样品的浪费。如果对混合物进行全分析，需要多次进样，耗时较长。例如，植物精油的全

22、分析，一维色谱分离约1小时，2一3分钟切割一次，需要20多次进样，样品的全分析需要耗时30一40小时。所以，传统的中心切割多维气相色谱，更适合于复杂体系中目标成分的分析。不适合样品全分析。GC+GC 核心技术(柱切换技术)：柱切换装置是多维气相色谱的心脏部件，一般有两种类型的切换技术，即阀切换和压力切换。阀切换：,切换阀采用四通阀或六通阀。阀切换的优点：流程简单，操作方便。缺点：阀死体积大，吸附活性强，耐温性差，易磨损漏气。,压力切换技术,压力切换原理是英国ICI石油公司Deans在1968年首先提出的。中心切割式多维气相色谱可实现如下功能:中心切割、旁通、反吹、两柱分流等。压力中心切割是其最

23、重要功能,其次是反吹功能。2007年，安捷伦公司首先推出了微板流路技术(Capillary flow technology)，利用光电雕刻技术，在两片不锈钢平板上刻划出毛细管气路，然后将板粘合起来，制成Deans切换装置。系统死体积更小，毛细柱安装更简便，活性较低(不锈钢经过硅烷化处理)。,中心切割GC+GC-应用实例,烟草降烟碱、假木贼碱和新烟碱的手性分析,(J Chromatogr:B,2008,865:13),全二维GCGC技术,全二维气相色谱气相色谱作为一种重要的分离分析挥发性和半挥发性有机化合物的工具,在石油、化工、地质、环保等领域中得到了广泛的应用。但是,在对组分数多达几千的复杂体

24、系进行分析时,传统的一维色谱(1DGC)不仅费时,而且由于峰容量不够,峰重叠十分严重。中心切割式二维色谱(GC+GC)等,只能实现对部分感兴趣组分的分离,无法对各组分进行准确的定性和定量。20 世纪90 年代初,Liu 和Phillips 提出的全二维气相色谱(GC GC)方法,提供了一种真正的正交分离系统。它是将分离机理不同而又互相独立的两支色谱柱以串连的方式结合成二维气相色谱,经第1支色谱柱分离后的每一个馏分,经调制器聚焦后以脉冲方式进入第2 支色谱柱中进行进一步的分离,通过温度和极性的改变实现气相色谱分离特性的正交化。GC GC 具有峰容量大(为两根柱各自峰容量的乘积)、分析速度快、分辨

25、率高、族分离等特点,因而该方法在复杂体系的分析方面具有其它方法无法比拟的优势,是目前色谱领域最活跃的研究和应用方向之一。GC GC 具有峰容量:第1支色谱柱峰容量为 n1，第2 支色谱柱峰容量n2，则GC GC 理论峰容量为n1 n2。,(J Chromatogr.Sci.,1991,29:227;Trends in Anal.Chem.,2006.25：438;540;726),GC GC的原理,试样从进样口导入第一柱(一般为较长或者液膜较厚的非极性柱),各化合物根据沸点不同进行第一维分离,然后经调制器聚焦,以脉冲方式(区带转移)进入第二柱(一般为较短或液膜较薄的极性柱或中等极性柱)。第一柱

26、中因沸点相近而未分离的化合物再根据极性大小不同进行第二维分离,检测器检测到的响应信号经数据采集软件处理后,得到三维色谱图,或者是二维轮廓图。根据三维色谱图或二维轮廓图中色谱峰的位置和峰体积,得到各组分的定性和定量信息。因调制器对第一柱流出物具有聚焦作用,而且调制器的脉冲周期很短,故不会造成第二维谱带的扩宽,保持了第一维分离原有的分辨率。通常,第二柱的柱长比第一柱短很多,固定相的厚度也不如第一柱,因而第二柱分离速度比第一柱快得多,这保证了在较短的脉冲周期内完成第二维分离,不会导致前后两次脉冲流出的组分相互交叉或重叠。,(Trends in Anal.Chem.,25:438;Trends in

27、Anal.Chem.,21:573),GC GC的原理（2）,GC GC 的正交分离是通过线性程序升温的方法和固定相极性的改变两者共同作用而实现的。仅仅依靠两维固定相极性的改变是不能保证两维完全不相关的,因为在恒温条件下,在非极性柱上保留强的物质在极性柱上也会保留强,高沸点的物质在第一维和第二维出峰都晚,而低沸点物质则都早。如果结合使用线性程序升温的方法,那么高沸点物质相对于低沸点的同类化合物进入第二柱晚但得到了温度补偿,沸点越高温度补偿越大,这样就可以消除两维相关,实现真正的正交分离,同时充分利用了GC GC 的二维分离空间。,根据化合物所属类型,GC GC 谱图被明显地分割成不同的区带,每

28、一区带代表特定的族,同一族化合物在其区带内按照沸点大小不同进行分离,如烷烃、环烷烃、单环芳烃和多环芳烃等分别分布在不同的区带内,这就是GC GC 的族分离。,GC GC的设计原则,在一次色谱运行周期中，两根独立的色谱柱有机地实现各自的分离；从第一根色谱柱流出的所有组分都必须进入第二根色谱柱（区别GC+GC）；为保护第一根色谱柱的分离成果：1）调制器必须足够的快（时间单位：s）；2）第二根色谱柱足够的短（一般在1-2m）；执行分离的时间足够的短；3）检测器的检测和数据采集时间与第二根柱子相匹配。,GC GC方法的实现,第1维柱:1)长柱、较宽内径、厚膜；2）非极性；调制器（Modulator):

29、1)等时间聚焦第一维柱子流出的组分；（区带压缩效应，提高灵敏度）2）以“注射”的方式将聚焦的组分进样到第2维的色谱柱；3）周期性，动作迅速干净；第2维柱：1）短柱、较窄内径、薄膜；（快速分离）2）具有极性或选择性；,检测器：1）快速响应，数据采集频率在50Hz以上；2）目前适用的检测器有：FID，ECD，TOF/MS,四极杆质谱检测器刚被开发出来。,GC GC的调制器,调制器是GC GC 仪器中最关键的部分，仍在不断改进中。热调制器：一种含金导电涂层的热调制器,通过一个电热套管将试样迅速从调制柱冲洗出来并聚焦成一个更窄的区带。方法缺乏稳定性,调制器的使用寿命也有限。另外的热调制器是通过移动加热

30、来聚焦分析物(即热扫帚方式)。冷阱热解析调制器：1）径向调制冷却系统(LMCS)：通过径向往复移动,馏分按次序被捕集和释放。这一系统是Kinghorn 研究组开发的全二维气相色谱系统,Kinghorn 认为径向冷阱热解析调制器是最好的调制器。2）复合式冷阱喷射系统：将馏分在两个区域聚焦,下游区的馏分被赶入第二柱,通过关闭、转移喷头或在冷柱上吹热气实现馏分的释放。阀调制器：通过一个六通阀收集第一柱流出的馏分并周期性地将其注射进第二柱,与通常的阀调制不同的是,有80%的第一柱流出物被注射进第二柱并到达检测器,因而具有较高的灵敏度。可应用于二维液相色谱。,GC GC的调制器,(Trends in A

31、nal.Chem.,2006.25:540;),LECO 公司GC GC仪器,GC GC的定性,GC GC高峰容量、高灵敏度、高分辨率、族分离和分析速度快等特点。根据分析目的不同,有两种分离类型常常被用于组分的定性和定量,即族分离和目标化合物分离。族分离要求具有相同特性(如分子结构、形状及与固定相的相互作用等)的一组化合物与其它化合物组彼此分离。目标化合物分离则需要将感兴趣的组分与其它组分及基体进行有效分离。GC GC 定性的可靠性比一维色谱强得多,但是其定性方法与一维色谱相比并没有本质的不同。既可以根据各化合物或各化合物组在二维坐标中的保留时间并借助于参考标样来定性,也可以通过与高速质谱的联

32、用来定性。,族分离及目标化合物分离,族分离:根据化合物所属类型,GC GC 谱图被明显地分割成不同的区带,每一区带代表特定的族,同一族化合物在其区带内按照沸点大小不同进行分离,如烷烃、环烷烃、单环芳烃和多环芳烃等分别分布在不同的区带内。,(Trends in Anal.Chem.,25:438;J.Chromatogr.A,2004,1054:47),GC GC的定量,GCGC 定量与一维色谱定量相比有以下几个优点:(1)GCGC 由色谱峰重叠引起的干扰更小,更容易对各组分定量;(2)组分通过GCGC 第2 柱的速度很快,相同量的某一组分在1DGC 中需要几秒钟通过检测器,而在GCGC 中该组

33、分被分割成几块碎片,每一碎片通过检测器的时间仅为100 ms 左右,因此GCGC 的峰形更尖税,灵敏度也更高;(3)真正的基线分离,有利于准确的积分;(4)调制器作用使信噪比大大提高。定量分析方法：对某一化合物定量时,可以先计算其总峰高、总峰面积 或峰体积,然后通过归一化法、外标法 或内标标准曲线法来进行定量。GC GC因分辨率大大增加，谱图中有传统一维色谱中不存在的空白区域,真正的基线总是存在，因而峰的起点和终点很容易识别,峰的积分结果也更可信。化学计量学技术辅助重叠峰的定量：化学计量学应用于GCGC 分析的一个关键的问题是:较短的第二柱能够提供必要的重现性,而且两柱间应有精确的试样传送机制

34、。能用于多道检测器色谱重叠峰去卷积的化学计量学算法有很多。渐进因子分析(EFA)是一种多变量分辩技术,能够分辩出三个以上的重叠峰。通用性的排列灭绝方法(GRAM)要求采用较短的GC 柱进行分析以获得高精度的保留时间,通过比较两套多维数据(数据矩阵),来测定未知试样中各重叠组分相对于校正用的标准试样中各组分的浓度比。,GC GC的最新进展,四极杆质谱与全二维气相色谱联用以非极性柱作为第一维色谱，以最近研制的离子液体毛细管色谱柱作为第二维色谱。离子液体毛细管色谱柱具有更高的热稳定性和极性，从而增加了上述二维系统的正交性。快速四极杆质谱在m/z 40 330 的质量扫描范围内可以达到50 Hz 的谱

35、图采集频率，这样就保证了每个峰可采集超过15 个数据点，满足了全二维气相色谱峰重构的需要。（Anal Chem.，2010，82:8583）利用欧氏距离和谱图相关性优化的峰匹配新算法(DISCO)全二维气相色谱/飞行时间质谱系统(GC GC/TOF-MS)可以获得海量的数据，当分析批量样品(如在代谢组学研究中)时，其数据处理尤为困难。美国路易斯维尔大学的Zhang 研究组发展了利用欧氏距离和谱图相关性优化的峰匹配新算法(DISCO)，并将其用于GC GC/TOF-MS的代谢组学分析。该算法已经被写入MATLAB R2008b 软件包中。（Anal Chem.，2010，82:5069）全二维气

36、相色谱-飞行时间质谱应用于化学武器前体痕量杂质的特征指纹分析（Anal Chem.，2010，82:689）,LC LC技术,二（多）维液相色谱简介对于复杂样品的分离,一维色谱往往不能提供足够的分辨率和峰容量。Davis和Giddings指出,组合不同的分离模式构建二维甚至多维液相分离系统是解决这一问题的有效途径。多维液相色谱(MDLC)技术:是指样品经过二种或多种不同分离模式的分离。在各维色谱分离模式完全不相关时,其总分辨率等于各维分辨率平方和的平方根,总的峰容量等于各维峰容量的乘积。分辨率和峰容量有了极大的提高。Jorgenson 等人早在1990 年在研究“中心切割”技术的基础上第一次实

37、现了“全二维切割”。20 世纪90 年代,作为功能基因组学的重要支柱 蛋白质组学的出现,使得多维色谱的研究再次成为色谱学家研究的热点。理论上,多维液相色谱系统可以组合的分离模式的数目即系统的维数并没有限制。但实际应用中受仪器成本、操作复杂性、检测池体积和检测器选择性等因素的制约,目前的多维液相色谱基本上为二维液相色谱(2D-LC)。二维液相色谱可分为离线(off-line)和在线(on-line)两大类。离线模式操作简单,每一维分离条件可独立优化。在线模式则是将第一维馏分中感兴趣的部分直接,或是利用接口交替收集,并按一定的频率进入第二维进行分离。与离线模式相比,在线模式具有分析速度快、自动化程

38、度高、重复性好等优点。,(Anal.Chem.,55:418;Anal.Chem.,62:161;.,29:1763),二维液相色谱原理,二维液相色谱通常采用两种不同的分离机理分析样品，即利用样品的不同特性把复杂混合物(如肽)分成单一组分，这些特性包括分子尺寸、等电点、亲水性、电荷、特殊分子间作用(亲和)等，在一维中不能完全分离的组分，可能在二维系统中得到更好的分离，分离能力、分辨率得到极大的提高。全多维液相色谱模式(Comprehensive HPLC)。基于Giddings 的理论，一般认为全多维分离应满足3个条件：1)样品的每一部分都受到不同模式的分离；2)所有样品组分以相等的比例(10

39、0或稍低一些，即并不要求100分析物，只要分流的部分能代表所有样品组分信息即可)转移到二维及检测器中；3)在一维中已得到的分辨率基本上维持不变。“基本”指通过测量全二维中第一维轴上的某个特殊峰所对应的第一维的分辩率与一维情况相比减少不超过10。其中，第一条和第三条说明了传统的中心切割与全二维的区别。,(色谱,2010 28:1117；中国科学 B 辑:化学,2009,39:670),构建二维液相应该解决的四个问题,两维流动相是否兼容。两维流动相不兼容时,色谱峰会展宽、变形,对最后的检测造成严重干扰。如果两维流动相黏度差别较大,还会产生所谓的黏性指迹(viscous fingering)现象,流

40、动相流动不稳,影响分离。第一维切割馏分的转移体积。第一维切割馏分的转移体积不能大于第二维色谱柱的最大进样体积。如果第一维馏分的切割体积较大,可以在第一维柱后进行分流,但这会降低二维液相色谱系统的灵敏度。样品的稀释和重新聚焦。经过第一维分离后,洗脱产物会被第一维流动相稀释。同时,洗脱产物在接口中会发生扩散,谱带展宽。在第二维色谱柱上,第一维的流动相必须比第二维的流动相洗脱强度弱,否则第一维洗脱产物不能在第二维柱头聚焦。第二维的分离速度。全二维液相色谱,第二维分离速度必须足够快。第二维进样频率越高,整个系统的选择性和峰容量越高。,(J.Chromatogr.A,2006,1120:282;Anal

41、.Chem.,2004,76:2525),二维液相分离的正交性,常用的液相色谱模式有:体积排阻色谱(SEC)、反相(RP)色谱、亲合色谱(AC)、正相(NP)色谱、手性(chiral)色谱、离子交换色谱(IEC)、亲水作用色谱(HILIC)等。组合不同的二维正交体系：将上述不同分离机制的色谱模式进行组合即可得到不同的二维体系,如体积排阻色谱-反相色谱(SEC-RP)、离子交换色谱-反相色谱(IEC-RP)、亲水作用色谱-反相色谱(HILIC-RP)、亲合色谱-反相色谱(AC-RP)、正相色谱-反相色谱(NP-RP)、反相色谱-手性色谱(RP-Chiral)。近来研究也有使用同种分离模式的二维体

42、系,如手性色谱-手性色谱(chiral-chiral)、反向色谱-反向色谱(RP-RP)和分子排阻色谱-分子排阻色谱(SEC-SEC),分离同样具有一定的正交性。,(化学进展,2007,19:1813;Anal.Chem.,2004,76:2525),二维液相色谱的接口技术,绝大部分的二维液相色谱系统是采用间接转移模式来完成两维分离之间的转换。间接转移模式二维液相色谱是通过一个特殊接口将第一维色谱柱和第二维色谱柱连接,接口收集第一维的洗脱产物,并将其转移到第二维。接口是二维液相色谱的核心,接口的设计决定了二维联用系统的实际分离效能。1）样品环接口；2）捕集柱接口；3）平行柱接口；4）停流接口；

43、5）真空辅助溶剂蒸发接口。,(色谱.,2010 28:1117;J.Chromatogr.A,2010,1217:5477),二维液相色谱的最新进展,二维液相色谱优化方法的最新进展在线二维液相色谱方法的优化过程中，分析时间、峰容量和稀释效应之间互相联系又互相制约，单纯优化某一参数往往会顾此失彼。优化时如何同时兼顾三者一直困扰着研究者。荷兰阿姆斯特丹大学Schoenmakers研究组将经济学领域广泛应用的帕累托最优(Pareto-Optimality)方法引入到在线二维液相色谱参数优化，提出了分析时间、峰容量和稀释效应在不损失任何一方的前提下达到三者最佳的方法，从而解决了这一难题。（Anal C

44、hem.，2010，82:8525）集成在微流控芯片上的二维液相色谱-毛细管电泳-电喷雾离子化系统美国北卡罗莱纳州大学Ramsey 研究组构建了集成在微流控芯片上的二维液相色谱-毛细管电泳-电喷雾离子化系统(2D-LC-CE-ESI)。该系统将样品捕集、液相通道、毛细管电泳通道和电喷雾喷口等多个功能单元集成到玻璃微流控芯片上，柱外效应明显减小，保证了低流速下不会产生明显的峰展宽。（Anal Chem.，2011，83:842）反相-反相二维液相色谱高效分离分析磷酸化肽的新方法（Anal Chem.，2010，82:53）,四、色谱与质谱联用技术,质谱概述(mass spectrometry,M

45、S)质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结。从J.J.Thomson(1906年)制成第一台质谱仪，到现在已有100多年了，早期的质谱仪主要是用来进行同位素测定和无机元素分析，二十世纪四十年代以后开始用于有机物分析，六十年代出现了气相色谱-质谱联用仪，使质谱仪的应用领域大大扩展，开始成为有机物分析的重要仪器。计算机的应用又使质谱分析法发生了飞跃变化，使其技术更加成熟，使用更加方便。八十年代以后又出现了一

46、些新的质谱技术，如快原子轰击电离源，基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源，以及随之而来的比较成熟的液相色谱-质谱联用仪，感应耦合等离子体质谱仪，富立叶变换质谱仪等。九十年代又出现气相色谱-质谱-质谱联用仪,液相色谱-质谱-质谱联用仪。这些新的电离技术和新的质谱仪使质谱分析又取得了长足进展。目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、地质、能源、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。,(Trends in Anal.Chem.,2003.22：750;J.Chromatogr.A,1999,843:287),质谱仪分类,质谱仪种类非常多，工作原理和应用范围也有很大的

47、不同。从应用角度，质谱仪可以分为下面几类：有机质谱仪：由于应用特点不同又分为：1）气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）。在这类仪器中，由于质谱仪工作原理不同，又有气相色谱-四极质谱仪，气相色谱-飞行时间质谱仪，气相色谱-离子阱质谱仪等。2）液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）。同样，有液相色谱-四器极质谱仪，液相色谱-离子阱质谱仪，液相色谱-飞行时间质谱仪，以及各种各样的液相色谱-质谱-质谱联用仪。3）其他有机质谱仪，主要有：A）基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS）。B）富立叶变换质谱仪（FT-MS）。无机质谱仪，包括：1）火花源双聚焦质谱仪。2）感应耦合等离子体质谱仪（ICP

48、-MS）。3）二次离子质谱仪（SIMS）。同位素质谱仪。气体分析质谱仪。主要有呼气质谱仪，氦质谱检漏仪等。,质谱仪,质谱分析法主要是通过对样品的离子的质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。因此，质谱仪都必须有电离装置把样品电离为离子，有质量分析装置把不同质荷比的离子分开,经检测器检测之后可以得到样品的质谱图，由于有机样品,无机样品和同位素样品等具有不同形态、性质和不同的分析要求,所以，所用的电离装置、质量分析装置和检测装置有所不同。但是，不管是哪种类型的质谱仪，其基本组成是相同的。都包括离子源、质量分析器、检测器和真空系统。,离子源（1）-电子电离源,离子源的作用是将欲分析样品电离

49、，得到带有样品信息的离子。质谱仪的离子源种类很多。,电子电离源(Electron Ionization EI)：又称EI源，是应用最为广泛的离子源，它主要用于挥发性样品的电离。电子电离源由GC或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯丝F发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。一般情况下,灯丝F与接收极T之间的电压为70伏,所有的标准质谱图都是在70ev下做出的。在70ev电子碰撞作用下,有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子。由分子离子可以确定化合物分子量,由碎片离子可以得到化合物的结构。对于一些不稳定的化合物,在70ev的电子轰击下很难得

50、到分子离子。为了得到分子量，可以采用10-20ev的电子能量，不过此时仪器灵敏度将大大降低，需要加大样品的进样量。,离子源（2）-化学电离源和快原子轰击源,化学电离源(Chemical Ionization,EI)：有些化合物稳定性差，用EI方式不易得到分子离子,因而也就得不到分子量。为了得到分子量可以采用CI电离方式。CI和EI在结构上没有多大差别。或者说主体部件是共用的。其主要差别是CI源工作过程中要引进一种反应气体。反应气体可以是甲烷、异丁烷、氨等。反应气的量比样品气要大得多。灯丝发出的电子首先将反应气电离，然后反应气离子与样品分子进行离子-分子反应，并使样品气电离。,快原子轰击源（Fa