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1、第21章 免疫学方法技术,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法,抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（serological reaction)用于：抗原（微生物、细胞、激素、细胞因子、肿瘤标志物等）、抗体的检测。,特异性抗原抗体反应的可见性适当的比例和浓度可逆性,抗原抗体反应的特点,应 用,1、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病：伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。（2）检测自身抗体诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等。2、利用已知抗体检测未知抗原（1）鉴定病原菌：诊断疾病（2
2、）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原：确认运动员是否服用兴奋剂,沉淀反应,补体参与反应,中和反应,2,3,4,1,免疫标记,凝集反应,2,4,3,5,Ag-Ab 反应的基本类型,一、凝集反应（agglutination reaction）,概念：细菌、细胞等颗粒性抗原或包被有抗原的颗粒状物质（如聚苯乙烯乳胶等）与相应的抗体结合，出现肉眼可见的凝集团，称为凝集反应。1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与
3、相应抗体反应出现颗粒凝集现象。,细菌的鉴定和血型的检查,检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体,二、沉淀反应（precipitation）,概念：可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合，形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。在液体中进行出现絮状沉淀，在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。,1单向免疫扩散(single immunodiffusion)2双向免疫扩散(double immunodiffusion)3免疫电泳(immunoelectrophoresis)4免疫比浊(immunonephelometry),1、单向免疫扩散（single immun
4、odiffusion）：可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散，为一种半定量试验。,环的直径与抗原含量成正相关,2、双向免疫扩散（doule immunodiffusion）：抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。,3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）,常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。,1）简易免疫电泳先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线，,2）对流免疫电泳(c
5、ounter immunoelectrophoresis,CIEP)是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术,3）火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。可定量分析。,4、免疫比浊,在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成免疫复合物，液体混浊。用浊度计测量反应体系的浊度，可绘制标准曲线并依据浊度推算样品中抗原含量。,三、补体参与的反应,溶菌反应,细菌与相应Ab结合，可激活补体，使细菌溶解。主要发生于霍乱弧菌等G+菌，可用于细菌鉴定。,溶血反应,红细胞与相应抗体结合，通过激活补体使红
6、细胞溶解，可作为补体结合试验的指示系统。,补体结合反应,是一种在补体参与的条件下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统来测定有无相应抗原或抗体的血清学试验。,第二节 免疫标记技术,免疫标记技术（Immunolabelling technique）,概念：用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质未改变抗原抗体的免疫学特性，同时标记物极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。,荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）,放射性同位素：125I、
7、131I,酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶,免疫荧光检测法（IFA）,放射免疫检测法（RIA）,酶免疫检测法（EIA）,1抗体制备。多克隆抗体单克隆抗体，2标记物与标记方法。放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统。,免疫分析基本环节,3分析方式设计：非竞争方式、竞争方式；直接法、间接法；标记抗原、标记抗体；均相、非均相4.信号检测。与相应的标记物对应。主要为分光光度法、荧光光度法、化学发光检测法。,一、免疫荧光法(immunofluorescence,IF),概念：荧光素标记的抗体（抗原）与组织或细胞中的相应抗原（抗体）结合，借助于荧光显微镜或流式细胞仪对抗原（抗体）进行鉴定或定位。,（
8、1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。（2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。,免疫荧光法分类,免疫荧光法图示,Mouse kidney section,Laminin-green-fluorescent Qdot 565 IgG CD31-red-fluorescent Qdot 655 IgGNuclei-blue-fluorescent Hoechst 33342,Control,TSL
9、P,TSLP-AlexaFluor 488 Nuclei-propidium iodide,HASMC,流式细胞术（Flow Cytometry,FCM),概念：FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。,流式细胞仪的细胞分析原理,待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室
10、喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱，进入流动室。被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照时后发出荧光，被荧光光电倍增管接收，实现了细胞的定量分析。再通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现了细胞的分选。,流式细胞仪工作原理,二、酶免疫测定(enzyme immunoassay,EIA),概念：是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。常用的酶为：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酯酶（AP）,常用的方法如下：（1）酶联免疫吸附试验测定可溶性抗原或抗体（2）免疫细胞或组织化学测定组织中或细胞表面的抗原,1.免疫细胞或免疫组化
11、技术,概念：应用酶标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。,ICC,IHC,2.酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA),基本原理：是将过量抗体（抗原）包被于载体（聚苯乙烯微量反应板）上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。,ELISA试剂盒,1.双抗体夹心法,用于检测特异性抗原。方法：将已知抗体吸附于固相
12、载体加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。,2.间接法,用于检测特异性抗体。方法：将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。,HRP,亲合素,3.竞争法,用于抗原和半抗原（抗原决定簇少）的定量测定，也可用于测定抗体。方法：以测定抗原为例将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负
13、相关。,ELISA反应过程,动画演示,A.用已知抗原检测分泌性特异性抗体的B细胞B.用抗细胞因子抗体检测细胞分泌的细胞因子,4.酶联免疫斑点试验,ELlSA方法的技术要点 I,与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，由于载体不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品为载体一般多采用物理吸附法。除载体的理化性质外，受缓冲液的离子强度、pH值、包被时的温度和时间等多种因素的影响。用抗原或抗体包被后。固相载体表面往往尚残留少量未饱和的吸附位点，产生非特异吸附，导致本底偏高。为此常用15BSA，或含520小牛血清的PH9.6碳酸盐缓冲液注满凹孔，37
14、作用1h，可以消除此种干扰。这一过程称为封闭(blocking)。,固相载体和免疫吸附剂的制备,ELlSA方法的技术要点 II,抗原和抗体,用于制备酶标记物和包被固相载体的抗原要求纯度高，抗原性完整；抗体需特异、效价高、亲和力强，并具有较高的比活性。如将抗体IgG用木瓜蛋白酶水解为Fab片段，再与酶连接，可以减少非特异性吸附，检测效果更佳。McAb的应用，进一步提高ELISA法的特异性和灵敏度。使用针对抗原分子中不同决定簇的两种McAb分别作为固相抗体和酶标抗体用于双位点夹心法，简化了操作程序。通常采用特异性较高的McAb作为固相包被抗体，与酶标记的多克隆抗体相结合进行检测，结果更为满意。,在
15、ELISA法中，用于标记抗体或抗原的酶与免疫酶组织化学技术基本上相同。但所用底物被酶裂解后，应能生成可溶性有色产物，适合用分光光度计(酶标仪)测量光密度值，籍以定量测定样品中待捡抗原或抗体的含量。,ELlSA方法的技术要点 III,常用的酶及其底物,辣根过氧化物酶(HRP)OPD,TMB碱性磷酸酶(AP)PNP半乳糖苷酶(Gal)NPG葡萄糖氧化酶(GOP)PAP,三、放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA),概念：是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I
16、131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。,结合相,游离相,基本原理：RIA是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合。,示意图,RIA法原理及标准曲线,75,50,30,10,0,1,10,100,1000,未标记抗原浓度（ng/ml),结合/未结合的放射活性（%）,四、化学发光免疫分析,概念：将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。灵敏，无污染，可用于替代放射免疫。,五、免疫胶体金标记技术(i
17、mmunogold labeling technique),概念：是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术；胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。电镜：高电子密度试纸：胶体金的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化。,胶体金是氯金酸(HAuCl4)的水溶胶颗粒，具有高电子密度，在电镜中颗粒致密，易于辨认，定位比酶反应物精确。,胶体金标记,举例：胶体金试纸检测尿HCG,早孕尿试纸条：两条杠，检测迅速，灵敏度高
18、,1）干燥试纸条,胶体金免疫快速检测HCG原理,2）加样,1.双抗体夹心法-大分子抗原,3）反应和迁徙,4）阳性结果：两条红线,5）阴性结果：一条红线,胶体金免疫试纸构造,六、免疫印迹技术,免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。凝胶电泳和固相免疫测定技术将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。,Western bl
19、ot method,包括5个步骤：1)固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2)封闭：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。,第三节检测淋巴细胞及其功能的体外试验,单个核细胞的分离,淋巴细胞亚群的分离,T细胞功能检测,B细胞功能检测,种类,免疫细胞及其亚类分离、鉴定和检测,淋巴细胞功能测定,T细胞的鉴定和检测,B细胞的鉴定和检测,一、免
20、疫细胞及亚类分离、鉴定和检测,（一）外周血单个核细胞的分离,葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）：密度梯度离心法,淋巴细胞分离液,各细胞与分离液的密度,进一步纯化淋巴细胞，铺于培养皿上，由于单核细胞易与玻璃黏附而滞留于平皿表面，未吸附的细胞即主要是淋巴细胞。,（二）淋巴细胞亚群的分离,尼龙棉分离法,E花结分离法,洗淘法,流式细胞术,混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞被选择性粘附于尼龙毛上，多数T细胞则通过尼龙毛柱,人T细胞与SRBC结合形成E花结，经密度梯度离心，花结形成细胞沉于管底；用低渗裂解花结中的SRBC即获得T细胞。,将已知抗特定标志的抗体包被培养板，加入淋
21、巴细胞悬液，相应的细胞即结合于培养板表面，与悬液中的其他细胞分离。,借助荧光活化细胞分类仪对细胞快速鉴定和分类、并进行多参数定量测定和综合分析的技术。,磁分离技术,将特异性抗体与磁性微粒交联，与表达相应膜抗原的细胞结合，应用强磁场分离所吸附的细胞，从而对特定的细胞进行分选,1、E玫瑰花环形成试验,（三）T细胞及其亚群的鉴定和检测,可用于T细胞的鉴定和检测。绵羊红细胞+人外周血淋巴细胞 4 12h 花环样细胞集团正常人外周血中E玫瑰花环形成细胞占淋巴细胞总数的6080%。,（三）T细胞及其亚群的鉴定和检测,2、T细胞单克隆抗体对T细胞及其亚群的鉴定和检测,所用的Ab主要有：CD3McAb、CD4
22、McAb和CD8McAb。方法：免疫荧光间接法。外周血淋巴细胞+分别用小鼠抗人CD3、CD4、CD8McAb（第一Ab）+荧光素标记的兔抗小鼠IgG抗体（第二Ab）荧光显微镜观察。,（三）T细胞及其亚群的鉴定和检测,2、T细胞单克隆抗体对T细胞及其亚群的鉴定和检测,结果：（1）被CD3McAb着染荧光的细胞是总T细胞。包括：TH、TH1、TH2、TC、TS细胞。（2）被CD4McAb着染荧光的细胞是TH、TH1、TH2（3）被CD8McAb着染荧光的细胞是TC、TS细胞。计数：100200个淋巴细胞，计算出染阳性细胞百分率：CD3T细胞占6580%。CD4T细胞占5060%。CD8T细胞占20
23、30%，CD4T细胞与CD8T细胞比值约2：1。,SmIgM/D是B细胞表面特有的标志。通过对该种标志的检测，可对B细胞进行鉴定和检测。方法：免疫荧光直接法。荧光素标记的兔抗人IgM/D抗体+外周血淋巴细胞 直接免疫荧光染色。着染荧光的细胞-B细胞。占淋巴细胞总数的812%。,（四）B细胞鉴定和检测,兔抗人IgM/D抗体,二、淋巴细胞功能测定,1、淋巴细胞转化试验,2、细胞毒性试验（LMC-T）,T细胞功能检测,1、溶血空斑试验,2、定量溶血分光光度测定法,B细胞功能检测,1、淋巴细胞转化试验,原理：T细胞 特异性Ag或有丝分裂原 淋巴母细胞（体积更大、代谢旺盛）根据其转化程度和转化率，测定机
24、体细胞免疫功能状态（1）非特异性转化试验（2）特异性转化试验,（一）T细胞功能检测,T细胞 植物血凝素（PHA）或刀豆蛋白A（Con A）淋巴母细胞。（有丝分裂原）正常人T细胞转化率约为70%。,（1）非特异性转化试验,1、淋巴细胞转化试验,（一）T细胞功能检测,原理：T细胞 特异性抗原（如结核菌素OT）或PPD 淋巴母细胞。转化率：530%。方法：外周血或分离的淋巴细胞+Ag 培养液72h 涂片，染色镜检。通过淋巴细胞形态学变化计算出转化百分率。,（2）特异性转化试验,（一）T细胞功能检测,1、淋巴细胞转化试验,2、细胞毒性试验（LMC-T）,测定致敏细胞毒T细胞（TC或CTL）杀伤靶细胞的
25、能力,用于肿瘤患者检测致敏T细胞的杀伤能力，判断治疗效果和预后。,（一）T细胞功能检测,1、溶血空斑试验,目的：检测和计数产生IgM及其他Ab生成的细胞（浆细胞）方法：（1）将绵羊红细胞（SRBC）免疫4天后的小鼠脾细胞（内含浆细胞）与SRBC在凝胶中混匀。（2）倾注于平板进行孵育，使Ab形成细胞（AFC）周围的SRBC被AFC产生的Ab致敏。（3）在平板表面加豚鼠新鲜补体进行第二次孵育，致敏SRBC激活补体而发生溶解。在AFC周围出现肉眼可见的溶血斑。溶血斑数目的多少能够反映B细胞产生Ab能力的强弱。,（二）B细胞功能检测,溶血空斑形成示意图,（1）直接溶血空斑试验法-检测分泌IgM的抗体形
26、成细胞,直接溶血空斑试验作用机制示意图,1、溶血空斑试验,（二）B细胞功能检测,（2）间接溶血空斑试验法-检测分泌IgG的抗体形成细胞。方法：前两步与直接法相同，第三步需加入抗IgG或其他抗Ab，再加豚鼠新鲜补体进行观察。,间接溶血空斑试验作用机制示意图,（二）B细胞功能检测,1、溶血空斑试验,根据溶血空斑试验原理衍化而来。将绵羊红细胞免疫小鼠后获得的脾细胞（含抗体形成细胞）与绵羊红细胞（SRBC）及豚鼠新鲜血清（补体）按一定比例混合，37水浴1小时后SRBC溶解，释放血红蛋白，离心后上清液中的血红蛋白可用分光光度计定量测定。所获上清液吸光值与抗体形成细胞（浆细胞）分泌的抗体量成正比。,2、定量溶血分光光度测定法,（二）B细胞功能检测,
