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1、SARS冠状病毒的生物学特性及分子生物学检测在SARS冠状病 毒检测中的应用,蔡剑平,卫生部临床检验中心,一、冠状病毒的生物学特性,冠状病毒是正链RNA病毒，在电镜下，病毒颗粒呈不规则形，直径约为60220nm,平均直径为100nm,呈球型或椭圆型，具有多型性，病毒有包膜，其表面有梅花形的棘突，状如皇冠，故称为冠状病毒(coronavirus)。颗粒中心在负染电镜下呈不定形态，核壳体呈疏松状态。1975年国际病毒命名委员会正式命名了冠状病毒科，分为冠状病毒和环曲病毒两个属。,冠状病毒结构蛋白主要有核蛋白、膜蛋白、棘突糖蛋白红细胞凝集素酯酶糖蛋白。包膜上有两种糖蛋白：S蛋白：棘突糖蛋白，是主要的
2、抗原，与受体结合，使细胞融合。M蛋白：跨膜，参与包膜形成。在一些亚类中，还有第三种糖蛋白,HE红细胞凝集素酯酶糖蛋白。核蛋白为磷酸化蛋白，可以与基因组RNA结合形成核衣壳，可以诱导细胞免疫。,冠状病毒拥有RNA病毒中最大的基因组，长度大约27-32kb，冠状病毒基因组具有5端帽状结构和3端polyA尾。冠状病毒的另一个特点是：各个结构蛋白成熟的mRNA的合成没有转录后的修饰剪切过程，而是直接在初次转录过程中，通过RNA聚合酶和一些转录因子以一种“不连续转录“的机制，通过识别特定的转录调控序列UCUAAAC有选择性地从负义链RNA上，一次性转录得到构成一个成熟mRNA的全部组成成分。,冠状病毒复
3、制过程：冠状病毒粒子进入宿主细胞后，首先将直接以病毒基因组RNA为模板翻译出病毒RNA聚合酶。然后才利用该酶完成负链亚基因组RNA(submRNA)的转录合成、各结构蛋白mRNA的合成，以及病毒基因组RNA的复制。结构蛋白和基因组RNA复制完成后，将在宿主细胞内质网处装配生成新的冠状病毒颗粒，并通过高尔基体分泌到细胞外，完成其整个病毒的生命周期。,向NCBI的GenBank申请登录的SARS病毒基因组 全序列的长度和主要单位,1、加拿大（BCCA Genome Sciences Centre,British Columbia Centre for Disease Control and Nat
4、ional Microbiology Laboratory Canada）长度：29751bp ss-RNA,2、美国（BCCA Genome Sciences Centre,British Columbia Centre for Disease Control and National Microbiology Laboratory Canada）长度：29727bp ss-RNA,3、中国香港中文大学（Chinese University of Hong Kong,China）长度：29736bp ss-RNA,4、中国香港大学（The University of Hong Kong,Ch
5、ina）长度：29742bp ss-RNA,5、北京基因组研究所（Beijing Genomics Institute,Chinese Academy of Sciences,Beijing,Beijing 101300,China）长度：29725bp ss-RNA,SARS病毒基因组与其他冠状病毒的结构相似。SARS病毒基因组初步的基因组注释在NCBI完成，预测得到的主要蛋白质有RNA聚合酶蛋白(聚合酶1a,1b)，S蛋白(spike protein)，E蛋白(smallmembrane protein)，N蛋白(nucleocapsid protein)等。冠状病毒的基因排列顺序均相同，
6、前后顺序为聚合酶、S蛋白、M蛋白、N蛋白。还有一些阅读框架编码的非结构蛋白，这些蛋白的功能尚不清楚。,冠状病毒的进化关系树SARS病毒明显不同于同其他三个冠状病毒群，可能归属于新的冠状病毒群。和其他人类及动物冠状病毒相比，核酸序列相似性分数是0.56-0.63，氨基酸序列的相似性分数是0.57-0.74。,冠状病毒的一般流行病学特点：,冠状病毒是成人普通感冒的主要病毒之一，可引起上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道；潜伏期一般为2-5天，平均为3天。典型的冠状病毒感染呈现流涕、不适等感冒症状。病 程一般在一周左右，临床过程轻微，没有后遗症。冠状病毒也可引起儿童的急性胃肠炎，严重者可出现 血水样便
7、。呼吸道冠状病毒感染通过空气飞沫传播，感染高峰在 秋冬或早春。冠状病毒感染引起的免疫应答较差，可以再次感染。,SARS冠状病毒的流行病学特点：,2002年11月份开始在我国广东地区出现的以发热、肺部感染为特征的疾病被称为传染性非典型性肺炎，国际上称为严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome，简称SARS）。截止2003年5月26日止，全球已有31个国家发现了SARS病例，全球累计病例数达到8202例，我国内地有25个省市自治区有该病流行，累计病例数达到5316例。SARS的流行病学特点及临床过程与以往的冠状病毒感染有极大的不同，大多数SARS发生在
8、青壮年。SARS的最常见的传染途径为密切接触，包括传染性的飞沫以及直接与传染性体液接触。我国专家总结出SARS传播的五大特点：有慢性病的老人感染SARS后易成超级传播者；所有感染者均与上一患者有症状期接触；接触越密切，就越容易被感染；未发现潜伏期SARS病人具有传染性；隔离病人可终止进一步传播。,对SARS病毒存活时间的研究：,现在已经非常肯定，SARS病毒可以随粪便、呼吸道分泌物和尿液排出。根据WHO多中心SARS协作组的研究显示，室温下病毒在大小便里至少能存活1-2天，在腹泻病人的大便里（它的pH值比正常大便高）能存活到4天以上，在塑料的表面可以存活24小时。细胞培养上清中的病毒置于4C
9、和-80C 21天后，病毒滴度只有轻微下降。细胞培养上清中的病毒在室温放置两天后滴度只下降了一个数量级，在加热到56C后，病毒滴度每15分钟下降大约10000个单位。,SARS患者的潜伏期:,从SARS病毒感染到发病的时间为潜伏期。潜伏期的概念对于SARS患者的控制措施：包括接触史追踪、SARS确诊病例密切接触者的家居隔离时间等尤为重要；对于潜伏期的认知还可以帮助临床医生诊断病人现有的症状和临床表现是否可诊断为SARS。WHO使用SARS个案资料重新评价了SARS的潜伏期。WHO认为SARS最长潜伏期仍然维持在10天。但由于感染途径、病毒量、免疫力等各种因素的不同，潜伏期也不尽相同。有些病人存
10、在多重感染病毒的情况，因此潜伏期的估算就更为不确定。,SARS病毒致病的临床过程：,目前研究认为，SARS发病可能经过病毒侵入和复制阶段，过度免疫应答阶段和急性肺损伤三个阶段。了解病毒入侵宿主细胞和复制的机制，在SARS病毒生命周期进行适时的检测和适当的阻断，可达到诊断和治疗的目的，目前该方面的研究已有一定进展。各种研究都显示，SARS病人的痰液、血液、粪便、鼻咽分泌物、尿液等临床标本都可检出SARS病毒，因此都可以作为分子生物学诊断的材料。,德国学者用不同的PCR方法对不同的临床标本进行SARS检测的结果,标本,PCR结果,IN-2IN-4,SAR1sSAR1As,BNIoutS2BNIou
11、tAS,BNIoutS2BNIoutASAnd nestedBNIinsBNIinAS,Real-Time PCR,细胞培养,病人1,病人2,病人3,Sputum,day9,Thyoat swab,day9,Nasal,day9,Plasma,day9,BAL,day11,Stool,day25,Sputum,day3,Thyoat swab,day3,Nasal,day3,Plasma,day3,Stool,day19,Sputum,day5,Plasma,day5,Stool,day21,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,ND,
12、-,-,-,-,ND,ND,+,-,-,-,+,-,-,ND,ND,ND,ND,ND,-,-,-,-,+,-,-,-,-,-,-,-,-,ND,ND,ND,ND,8.3X106,1.0X108,800,800,190,4.1X105,6.3X104,-,-,-,-,-,-,+,+,香港学者用定量RT-PCR检测患者体内SRAS-CoV的变化(from Peiris J S M.2003),二、分子生物学检测在SARS冠状病 毒检测中的应用,WHO建议：SARS诊断仍然依赖于非典型肺炎的临床体征为主。目前可用于SARS实验室检测的主要方法如下：1、抗体检测：（1）ELISA检测SARS病人血清中
13、的抗体，在首次发现症状21天后 比较可靠。（2）免疫荧光检测法，在疾病开始10天后就能检测血清中的抗 体。该种方法需要固定SARS病毒，免疫荧光显微镜和有经 验的技术人员。抗体检测阳性表示该病人感染了SARS病毒。,2、分子检测：用RT-PCR来检测特异的SARS病毒的RNA片段.这种方法可以检测自发病开始后10天内的SARS病人。该方法阴性结果不能排除SARS感染。3、细胞培养:利用VERO 细胞来检测SARS病人的呼吸道分泌物和血液样品，阳性结果表示SARS病人感染了冠状病毒，阴性结果不能排除SARS感染。,分子生物学检测：,目前的研究表明，聚合酶链反应（PCR法）能够在不同的样品中检测出
14、SARS冠状病毒的基因物质。WHO4月中旬公布了可用于SARS病毒检测的7对引物。目前用于SARS冠状病毒检测的PCR法有以下三种：1）传统RT-PCR法；2）套式RT-PCR法；3）实时RT-PCR法。套式RT-PCR法和实时RT-PCR法均有较高的敏感度，已在SARS病毒的科研和临床检测中得到广泛应用。,Cor-p-F2,Cor-p-F3,SAR1S,CoR-1,SAR1AS,Cor-p-R1,CoR-2,WHO于4月中旬公布的可用于SARS病毒检测的7对引物。,whoHKUsense,BNI outS,whoBNIoutS,BNIinS,whoBNIinS,whoHKUantisense
15、,BNIinaAS,whoBNIinAS,whoBNIoutAS,BNIoutAS,WHO于4月中旬公布的可用于SARS病毒检测的7对引物。,目前RT-PCR检测在SARS冠状病毒诊断中存在的问题：,目前国内外很多厂家都在第一时间推出了用于检测SARS冠状病毒的RT-PCR试剂盒，但试用结果表明，假阳性或假阴性的问题仍然是主要问题。我国卫生部组织了对某一单位提供的多聚酶链反应诊断SARS检测方法的验证工作，结果表明，对临床确诊病人组的检测阳性率为32.6%，方法改进后的阳性率为43.5%；对医学观察者的检测阳性率为53.3%，方法改进后的阳性率为23.3%；对正常人组的检测阳性率为30%，方法
16、改进后的阳性率为15%。卫生部认为该方法在改进前没有诊断意义，改进后的方法的敏感性和特异性仍有待提高。,实验室检测结果的解释：,实验室检测阳性结果的解释：表示这个SARS患者存在SARS病毒的感染。实验室检测阴性结果的解释：阴性结果并不能证明此人并未罹患SARS。SARS病例实验室检测结果阴性的原因可能包括：该患者并非由SARS病毒感染；可由其它传染性因素（病毒、细菌、真菌）或非传染性因素引起。实验结果不正确（“假阴性”）。现今的一些实验室检测体系仍需进一步提高其灵敏度。样本并未在病毒或其遗传物质表达时被采集。病毒及其遗传物质只在一个简短的时间表达，而且要视所用检测的类型而采集不同的样本。,阳
17、性结果的确认标准：,进行SARS特异性PCR检测的实验室应采用严格的阳性结果确认标准：1）在每次PCR操作中应包括恰当的对照，以产生预期的结果，这些对照应包括：用1份阴性对照以控制提取过程和潜在实验室的污染，用1份水样对照控制PCR的扩增反应。用1份阳性对照控制提取过程和PCR扩增反应。病人标本加上内对照以检测PCR抑制物（抑制对照）2）如果获得了阳性PCR结果，要用原始标本重复PCR反应或 用同一标本在另一个实验室测试方可证实。3）扩增基因组的不同区域可以增加检测的特异性。,（1）为了提高RT-PCR方法在SARS冠状病毒检测中的敏 感性，我们认为应注重以下几方面问题：1)对各种临床标本的SARS冠状病毒进行富集；2)对SARS冠状病毒RNA的抽提方法进行评价。（2）严格按PCR实验室管理规定实施操作，选用套式 RT-PCR进行SARS冠状病毒基因检测时，应特别注意 防止PCR扩增产物的污染。,我们的一点建议：,谢谢！,
