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1、第九章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合育种,原生质体育种微生物原生质体融合育种细菌原生质体融合育种放线菌原生质体融合育种酵母菌原生质体融合育种霉菌原生质体融合育种,第一节 原生质体育种,原生质体具有的新特性：1、对诱变剂敏感2、对噬菌体不敏感3、不受感受态影响,什么是原生质体？,包括：原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原生质体转化育种，原生质体融合育种及其他原生质体育种。,一、微生物原生质体再生育种 1原生质体再生育种的一般程序：出发菌株的选择菌种活化和预培养原生质体制备原生质体再生高产菌株分离（初筛）复筛遗传稳定性鉴定菌种特性及发酵特性研究。2原生质体再生育种实例 小单孢菌福堤霉素,
2、微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正突变株。,敏感，细胞壁的重建和分裂能力的再生，对数期细胞，不需要遗传标记,二、微生物原生质体诱变育种（一）原生质体诱变育种方法1物理诱变剂诱变原生质体的一般程序：取10 ml对数生长期微生物培养物，离心收集菌体，无菌水洗涤离心，菌体沉淀物用酶液悬浮，水解去壁制成原生质体离心，高渗溶液洗涤原生质体原生质体悬浮液稀释至一定密度，取适量放入无菌培养皿内将培养皿移至紫外灯下诱变处理置暗处后处理一定时间移入再生培养基中再生培养（由于原生质体较脆弱，用双层平板法再生）分离优质菌株突变株稳定性试验突变株鉴定。,是以微生物原生
3、质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。,2化学诱变剂诱变原生质体的一般程序 通常操作程序包括：出发菌株培养和原生质体制备及再生选择合适的化学诱变剂，配制成合适的浓度加入原生质体悬浮液，混合（含有高渗溶液，稳定原生质体）诱变处理离心弃诱变剂、原生质体沉淀用稳定液洗涤稀释、分离到再生平板上（双层平板法）再生培养观察、筛选突变株复筛突变株鉴定。原生质体诱变周期一般比常规诱变育种要长，难度更大。,（二）原生质体诱变育种实例1扩展青霉原生质体制备2、原生质体再生3、原生质体诱变4、突变株筛选,三、微生物原生质体转化育种 整条DNA或DNA片
4、段的转化四、微生物原生质融合育种五、其他微生物原生质体育种,第二节 微生物原生质体融合育种,用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得具有双亲优良性状于一体的稳定融合子。聚乙二醇诱导和电融和 聚乙二醇种内融合率可高达27%，种间的融合率也可达10%，比常规的杂交重组频率提高千倍以上。电场诱导融合又将融合率提高10倍。,原生质体融合育种的特点1、杂交率高2、受接合型或致育型的限制小3、遗传物质传递更为完整4、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能5
5、、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株6、提高菌株产量的潜力较大7、有助于建立工业微生物转化体系,原生质体融合育种五大步骤：直接亲本及其遗传标记选择；双亲本原生质体制备与再生；亲本原生质体诱导融合；融合重组体（称为融合子）分离；遗传特性分析与测定；,二、原生质体制备与再生（一）原生质体制备 最有效和最常用的是酶法。,一、直接亲本及其遗传标记的选择 一般把诱变系谱中筛选获得的不同正突变株作为直接亲本 直接亲本都带有遗传标记,超声波处理菌体释放原生质体酶解脱壁释放原生质体,处理细菌细胞壁用酶 溶菌酶Lysozyme处理放线菌细胞壁用酶 Lytic Enzyme裂解酶、Lysozyme溶菌酶,纤维
6、素酶 Cellulase 酵母裂解酶 Zymolyase 1,3葡聚糖酶几丁质酶 Chitinase商品酶 Novozyme234来自 Trichoderma harzianum Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶(for yeast),处理真菌用酶,原生质体的好坏与培养基成分、培养条件，菌龄和预处理等因素有关。1、酶法分离原生质体的影响因素（1）培养基组成（2）菌体培养方式：丝状菌常用平板玻璃纸法，细菌和酵母菌多用振荡沉没培养法。（3）菌体菌龄：丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生质体最佳。尤其是菌丝体尖端细胞。认为对数期的前期和对数期效果最好
7、。,酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化，才能大幅度地提高制备率；放线菌制备原生质体，以对数期到静止期的转换期比较理想，不仅制备量多，而且细胞壁再生能力也比较强；细菌适合在对数期分离原生质体（4）稳定剂：高渗溶液；无机盐对丝状真菌效果较好，而糖和糖醇对酵母更为合适，细菌多使用蔗糖或NaCl，（5）酶解前的预处理：SH-化合物（如巯基乙醇）广泛应用于酵母自和某些丝状真菌中，（6）酶系和酶的浓度：真菌-0.5蜗牛酶和0.5%纤维素酶，（7）酶的作用温度和作用pH值：通常细菌水解细胞壁的温度在 35左右。一般放线菌的温度在 3032。（8）菌体密度：（9）酶解方式：酶解时保持较好的通气条件和适当振荡
8、可促进原生质体释放和分离。,2原生质体的鉴别（1）低渗爆破法：（2）荧光染色法：3原生质体的收集和纯化（1）过滤法：使用沙心漏斗。（2）密度梯度离心法：（3）界面法：（4）漂浮法：,4原虫质体的活力鉴定（1）荧光素双醋酸盐（FDA）染色法（2）酚藏花红染色法（3）伊文恩篮染色法 5原生质体的保存（1）立即进行融合或其它方式育种（2）5的二甲亚矾或甘油等其他保护剂，液氮。,（二）原生质体再生 l、原生质体再生的影响因素菌体生理状态 稳定剂：酶浓度和酶作用时间 再生培养基：丝状真菌、酿酒酵母等的原生质体仅能在固体培养基上再生，在液体培养基中细胞壁再生不彻底，不能完全复原。再生培养基要用稳定剂配制，
9、还含有Ca2和Mg2+,浓度和原生质体形成时的酶解液相类似，菌种不同稍有差别。残存菌体的分离，原生质体密度 排除再生培养基上的冷凝水，再生方法，,2再生率及其计算细菌原生质体再生频率在90以上，放线菌的5060，真菌为2070。,三、原生质体融合（一）原生质体融合过程原生质体、PEG及适量的CaCl2、MgCl2,（二）原生质体融合的影响因素 1融合剂：不同种类微生物对PEG分于量的要求不尽相同。物理融合剂：电场和激光是原生质体融合 2温度：丝状真菌适宜融合的温度约为30；而细菌原生质体融合的适温往往偏低，据认为4或20比37更好；放线菌通常在常温（约20）下进行融合。总的来说在20-30下进
10、行融合效果较理想。融合处理时间从1min-1h，但大多数微生物110 min，3、亲株的亲和力和原生质体的活性 4无机离子：在PEG介导融合时，通常需要一定桩度的Ca2+、Mg2+有效地促进融合 5其他条件：细胞密度,四、融合体再生（一）融合体再生 双亲融合后形成的融合体不等于重组体，以霉菌来说，可能是异核体或杂合二倍体或重组体，它们融合后营养互补，经过再生，均可在基本培养基上形成菌落。酵母菌、细菌常用双层平板法，与融合前原生质霉菌和放线菌除了用双层平板法外，也可把原生质体直接分离到高渗培养基平板上，同样能得到再生菌落。,（二）融合体的检出与分离1利用营养缺陷型标记选择融合体2利用抗性选择融合
11、体3用灭活原生质体检出融合体4利用荧光染色法选择融合体5双亲对碳源利用不同而检出融合体6融合体的其他选择方法对昆虫的毒力测定进行融合体的选择利用形态差异选择 生化测定指标选择融合体,五、融合重组体检出于遗传分析分离重组体，并试验其遗传稳定性研究（一）重组体的检出和鉴别的方法1直接法2间接选择法3钝化选择法,（二）融合率 如采用直接法，融合率的计算公式为：融合率（）=基本培养基上再生的菌落/完全培养基上再生的菌落数100%如采用间接法融合率的记算公式为：融合率（%）重组体后代总数/所有后代总数100 各类微生物之间融合频率差别很大既使是同一个种的不同菌株也不一样。霉菌、放线菌融合率约为0.1%一10%，细菌和酵母菌为10-3一10-6。异种间融合率比同种间又低得多，如霉菌种间融合率约为0.1一1%，酵母菌、放线菌为10-5一10-7。,（三）DNA含量及孢子形态测定1DNA含量测定2单倍化 3有关酶活性及孢子体积的测定4分子生物学方法,六、原生质体融合的应用1提高产量或质量，合成新物质，新中间体2改良菌种遗传特性3优化菌种发酵特性4质粒转移5原生质体与细胞核融合6进行遗传分析,
