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1、第七章 原生质体的分离和培养,原生质体:是指植物细胞中除去细胞的壁的裸露部分.,特点:,1.有全套的遗传信息-可完成全能性:,2.同一时间获得遗传上的同质体,3.实现远缘杂交;,4.摄取外源DNA细胞器等-遗传转化的理想实体.,一,原生质体的分离,除去胞间层(粘着)-单细胞-除去细胞壁,酶解法:漆斑霉产生的纤维素酶(粗制剂)-分离番茄根尖 细胞原生质体,缺点:可能受到酶的影响,首先:产量高,活性强,能分裂,产生愈伤组织(胚状体),最终.形成完整植株的原生质,影响因素,取材,酶的种类,酶的渗透压,原生质膜的稳定剂,酶解的时间、温度、纯化方法等,分离:,1.表面消毒:,苄烷铵0.1%+酒精10%-
2、5min,60%70%酒精消毒30s-0.1%HgCl2-无菌水冲洗35次,2.酶解:,撕去叶片下表皮(向下)-漂浮于酶液中-,真空泵处理,35分钟,(2h后)分离出原生质体,3.酶,纤维素酶:消化细胞壁纤维素,果胶酶:降解中胶层,半纤维酶,酶的选择:,愈伤组织、悬浮细胞-浓度大 活动强的酶,叶片,浓度小,4.条件:黑暗,静止 轻摇,时间:几几十小时,温度 250C,(一).原生质体供体,1.取自植物体,多以叶片为主,易获得,酶处理简便,短时间可获得大量原生质体,继代培养保持胚性状态,利于获得原生质体,材料类型:,天然:田间:野生、温室、盆栽,人工材料:愈伤组织、悬浮、自制培养再生植 物、试管
3、苗,(2)注意事项:,a.选择具有形态分化潜力的材料;,b.选择酶处理后的大量原生质材料;,c.选择稳定性好,不易破碎;,d.选择活性高,可持续分裂,c.选择合适的基因型(关键),(2).材料的特性和生理状态,a.幼嫩叶片(天然);,b.45d无菌苗下胚轴;,d.未成熟种子胚的子叶;,e.禾本科植物、幼胚、幼穗、花药,外植体来源的愈伤组织:优点,a.幼嫩材料不受外界环境的影响;,b.实验的重复性好;,c.原生质体的产量、活性及稳定性好,d.可原生质的分化潜力做出初步估价.,(二).分离原生质体所用的酶类,1.酶的类型,纤维素酶类,果胶酶类,半纤维素酶类,都含有酚类、核酸酶、蛋白酶过氧化物酶杂质
4、,具一定毒性,2.酶的处理,凝胶柱过滤-酶液脱盐纯化,3.影响因素,*酶的活性与pH有关 4.76.0,*温度 4050OC 最适温度 原生质 25300C,时间 30min-20h,4.木、草本植物使用时间不同,5.时间 424h 1g材料+10ml,二 原生质的培养,1.过程:原生质-细胞再生-细胞分裂-细胞团芽和根,2.培养方法,细胞植板法,半固体培养基,琼脂糖,优点:位置固定,方便观察,多用液体培养基:,琼脂上细胞不易分裂,可降低渗透压,可更换培养基,可降低细胞密度,(一).原生质体活性试验,1.方法:,A.以胞质环流作为代谢活跃进行的指标;,B.以氧的摄入量做指标,可通过指示呼吸代谢
5、强度的氧电极 进行测定;,C.以光合活性做指标.,D以完整的质膜排斥伊月蓝的能力做指标.,E.以二乙酸荧光素的染色能力为指标,荧光素双醋酸酯(FDA)染色法,有活性:有内酯酶分解,分解-有荧光产生,无活性:无内酯酶,无荧光产生,方法:(1)原生质悬浮液0.5ml,置于10mm100mm的小 管中;,(2).加入贮于00C,含2mg/L的 FDA的丙酮溶液成质量分数为0.01%,混匀;,(3).置于室温下5min后,用荧光显微镜观察,有活力:荧光,无活力:无荧光,用荧光显微镜观察,有细胞壁 绿色荧光,无细胞壁:红色,(二).培养基,2.检测细胞壁是否除净荧光增白剂,将纯化后收集的原生质加入0.1
6、%-0.05%的荧光增白剂,染色510min.离心3min,再用0,7mol/L甘露洗去多余染料,如此重复3次.,1.营养成分,无机盐,有机物,激素,条件培养基:将生长迅速的细胞在液体培养基中培 养一段时间,除去细胞后收集的培养基.,Ph值 5.65.8,2.原生质体的培养方法,(1)液体培养,液体浅层培养,微滴培养,操作简便,伤害小,分布不均匀,多组合、单个融合,分布不均匀、易挥发,(2).固体培养-琼脂包埋,300C琼脂糖+原生质-培养皿底部,优点:提高植板效率 便于观察 易于统计,缺点:操作要求严格,(3)液固体结合培养,A.液体浅层固体平板双层培养法,优点:,固体培养基中的营养物质缓慢
7、释放,下层可吸收培养物产生的有害物质,B.琼脂糖珠培养,优点:改变了通气和营养环境 促进原生质分裂以及细胞团的形成,(4).饲养培养(看护培养),A.滤膜饲养法,B.琼脂糖珠的饲养培养,(三)植板密度,1 Kao-KM8P,优点:,单个细胞能生壁持续分裂,形成愈伤组织,2.饲养细胞层法,3.两种不同物种原生质共培养,此法适用于,两种原生质之间能发生有效的互馈,两种原生质的愈伤组织形态上可区分,(四)细胞分裂和愈伤组织形成,原生质体-细胞壁再生-细胞团愈伤组织-植株,1.壁的出现:原生质体-球型改变-微纤丝-细胞壁,培养,24d,2.细胞分裂:,27d第一次分裂-细胞团-愈伤组织-转移(不含渗透压的培养基中),23周,2周后,(1)细胞分裂不同步,(2).壁的形成与细胞分裂有直接关系,壁发育不全-,核分裂,质不分裂,原因:清洗不彻底,其它,(3).应加外源生长素和细胞分裂素,与材料有关,加入后引起死亡,加入时间不一,3.培养条件,(1)光:散射光或黑暗中培养(47d),(2).温 250300C以下,(3).及时添加培养基,及时转移固体培养基,(五).植株再生,1.需经历三种培养基:,原生质培养基-愈伤,分化培养基-芽,生根培养基-根,胚胎发生途径,原生质体-细胞团-去2.4D培养上-胚状体-植物,
