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1、实验要求,1.实验室规则&安全,2.不得缺席&小组长负责制,3.人人动脑动手&观测+实验报告,4.设计性实验的要求：开放性,小组团队协作讨论查阅资料讨论设计可行性报告定稿实施观测/记录/图片小论文,5.条件&责任,每组一套用具,今天清点/签名/押金实验结束后交还/退还押金,实验论文选登,烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生,摘要:在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。本实验通过烟草叶片外植体体外培养，诱导愈伤组织，并分化培养产生再生植株。Abstract：In the plant ti
2、ssue culture,the main target is to induce the callus forming and morphogenesis,thus makes a cell,a tissue or an organ in vitro forming the microspores by dedifferentiation,then a plant by redifferentiation.In this experiment we use the explant cultured in vitro to generate the callus and to be regen
3、erated the plant by differentiation.关键词:全能性；组织培养；愈伤组织；分化培养；无菌操作,1前言：细胞是生物体的基本结构单位和功能单位。细胞工程就是利用细胞的全能性，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术1。细胞工程所涉及的基本内容,包括细胞培养、细胞融合、细胞核移植、染色体添加、细胞器转移、胚胎分割、动植物克隆等一系列技术2。在植物学界，早在1902年德国的植物学家哈泊兰德就预言植物细胞的全能性。1934年荷兰的植物学家温特发现生长素，并证实了对植物细胞培
4、养的作用。1937年，在法国巴黎的Gautheret实验室、格勒诺布尔的Nobecourt实验室和普林斯顿的White实验室等几个实验室几乎同时获得植物培养物的愈伤组织并长期培养成功3。这是植物细胞与组织的首次成功。1960年，英国诺丁汉大学科金教授创造性地应用酶解的方法，首次成功地从番茄幼苗的根部制备到大量的原生质体。在此基础上，1972年美国的卡尔森等人用NaNO3作为融合诱导剂，将来自不同种的两个烟草原生质体进行融合，获得了世界上第一个体细胞杂种植株1。细胞工程技术给医学、农牧业带来巨大的变革。诸如组织培养等生物技术只需小量投资就可开发，但却能给农民带来实在的利益4。植物细胞和组织培养的
5、技术性强，要求无菌操作，通过本实验可初步掌握常规的组织培养技术，加深对无菌操作的了解,掌握植物愈伤组织诱导培养技术和调控条件，了解器官分化和植株再生的过程。,2材料与方法：材料：烟草无菌苗、烟草叶片愈伤组织方法：2.1培养基制备一般矿质盐浓度较高的基本培养基如MS,B5及改良培养基均可用于诱导愈伤组织5。本实验用的是MS培养基，它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。每个组配
6、2000 mL的培养基:向锅中依次加入培养基母液:大量元素 100mL 微量元素 20 mL 铁盐 20 mL维生素 20 mL 肌醇 10 mL 甘氨酸 10 mLBA和NAA 各8mL加入1800 mL蒸馏水,加入40g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5N的NaOH和0.5N的HCl调整PH至；加入14g琼脂,将锅置于电炉上,搅拌加热使其完全溶化,然后用蒸馏水定容至终体积2000 mL,继续加热使之混合均匀后分装于三角瓶中，用记号笔写上学号，姓名和日期；,分装好的培养基于121C灭菌20min左右，置于无菌室保存备用。2.2愈伤组织诱导将手洗净，用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作
7、；点燃酒精灯,将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干；取一无菌培养皿,然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中,并用锋利解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片；太小产生愈伤组织的能力弱，太大在培养基上的地方太大，所以大小应以适当为妥6。取一烟草叶片无菌培养瓶,打开烧瓶口；将切好的小叶片接种于培养瓶中,每瓶接5片；快速封好瓶口,用记号笔写上姓名和接种日期；接种后的三角瓶置于24C条件下，三瓶光培，三瓶暗培。注意：外植体切割时，动作要快，减少失水。2.3分化培养与植株再生组织诱导结果：统计诱导率；观察记载黑暗和光照条件下愈伤组织的差异，结合理论学习进行分析；将诱导产生的愈伤组织一一对应接入相同的培养基
8、上，标明取自光/暗材料；置于20-22C,光照条件下培养；培养一段时间后观察、统计结果。,3结果与分析3.1愈伤组织诱导愈伤组织诱导情况总共接入外植体30个,实际形成了21个愈伤组织,光照培养的有11个,黑暗培养的有10个。愈伤组织诱导率（%）=实际形成愈伤组织数/接种外植体数,烟草叶片愈伤组织诱导情况统计表,3.1.2 结果分析很多研究已证明,用于诱导形成器官的植物材料本身的生理状态,包括培养材料的组织类型及其相互的位置关系,器官、组织和细胞的生理或个体发育年龄等，以及在用愈伤组织进行实验时，诱导愈伤组织形成的条件，愈伤组织的年龄以及继代培养的代数和时间，均对培养中器官或胚状体形成有着明显的
9、影响7。植物全能性的发挥，除细胞本身的内在原因之外，培养时的光、温度及植物激素的应用也是十分重要的因素。其中，植物激素的调节起着十分决定性的作用。科学家们用烟草作试验发现，当细胞分裂素和生长素配合使用时，细胞分裂素的比例高，生长素的比例低，则细胞就产生芽；反过来，生长素的比例高就会生根。通过植物激素对培养材料的调节，使我们能更好地控制植物器官的分化方向8。本次愈伤组织诱导全部没有污染,但诱导率较低,总结原因可能有以下几个方面:(1)接入时,切取的外植体小片太小,难以发生细胞分裂9；(2)取材时切取的某些部位的叶片过于老化,很难诱导产生愈伤组织，而靠近胚柄部位的胚性才比较高；(3)可能接入前，镊
10、子在酒精灯上烧过之后未等冷却就接触了叶片,致使叶片烧伤受损；(4)可能培养基营养供应不足,致使某些愈伤组织因营养缺乏而死亡；,(5)其他因素如光照、温度、湿度、激素等方面可能没多大问题，因为同一组的其他成员诱导的愈伤组织的诱导率都普遍较高。比较光照和黑暗两处培养的愈伤组织的差别，主要体现在颜色上，光照条件下的愈伤组织颜色偏绿，而黑暗处组织没有光照，无法合成叶绿素，因而呈现淡黄色。,3.2分化培养与植株再生,分化情况取自光下的愈伤组织经分化培养后，三瓶都没有分化；暗处的愈伤组织分化培养后，只有一瓶里面有分化芽，该瓶原来接入2个愈伤组织，2个都分化了。分化率（%）=能够分化芽的愈伤组织/接种愈伤组
11、织数100,烟草叶片愈伤组织再生植株情况统计表,结果分析根据愈伤产生的速度和形成愈伤的类型,可以初步判断愈伤的质量,即产生再生植株的可能性。较好的愈伤组织多呈淡黄(绿)色或无色，疏密程度适中。过于紧实或过于疏松的愈伤都很难再诱导分化产生植株。愈伤组织结构应该是不均匀者为好，就是说在整团愈伤组织中应有一些颗粒状或成簇的小细胞团，这些小细胞团往往是分化产生植株的核心，有的称其为芽点或原始胚状体。一开始紧密坚实，呈现浓厚的绿色，质量不好，很难再分化出再生植株3。本实验失败的原因可能与上个步骤诱导产生的愈伤组织的质量有很大关系，产生的愈伤组织质地都相当紧密，结构也较均匀，不见一些颗粒状的小细胞团；另外
12、可能存在一些激素、营养供应等方面的原因使愈伤组织难以分化。还有很可能就是镊子取材时未冷却将组织烧伤，细胞已死亡。,4小结当植物的器官组织与完整植株分离之后,如果供给合适的营养和生长调节物质,它们在离体条件下由于受到伤害的刺激及生长调节物质的诱导,可恢复细胞分裂和生长分化的能力。因此植物的离体组织、器官、细胞或原生质体在无菌和适宜的人工培养条件下培养，能够产生愈伤组织，并长成植物体10。,植物组织培养的成功与否取决于外植体的制备、无菌操作和人工培养环境。外植体的制备是能否建成离体繁殖系要过的第一关。制备外植体的原则是无菌和有活性，无菌是外植体植被的要求，有杂菌带入培养基会造成微生物污染，而阻滞甚
13、至杀死外植体。有活性是外植体制备的前提，无活性的外植体的培养在植物组织培养中是无意义的。无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术，甚至可以说组织培养的前提就是无菌。实验室中经常使用的无菌操作设备是超净工作台。无菌操作者的操作手法和习惯也是无菌操作成功与否的关键，通常进行无菌操作的实验人员也要经过严密的无菌操作训练并建立严格的“无菌概念”。能否把植物组织培养做到满意的人工调控，关键在于人工培养环境。所有的多细胞植物都有诱发愈伤组织的可能，诱发成功的关键并不在于植物材料的来源，而在于培养条件7。培养环境是整个组织培养的难点和重点，也是近百年来植物生理学家一直探讨和研究的重要话题。人工培养环境
14、包括能量的来源光照，新陈代谢的保证温度，气水平衡湿度，生物原料的来源培养基。这与植物的自然环境是类似的，即光照、温湿度和土壤。SKoog和Miller的激素平衡概念已成为组织培养者的指导原理。他们指出,在烟草的愈伤组织上,培养基中细胞分裂素与生长素之间的比率,是决定生根还是生芽的关键。,5参考文献1李至勇编著.细胞工程.北京:科学出版社，2003，7:82邵健忠，陈晓萍，边红武.改造生命之舟细胞工程.浙江:浙江大学出版社，2002，93崔才德等编.植物组织培养与工厂化育苗.北京:化学工业出版社，2003，51:534赵学漱编著.创造生命的生物工程.北京:地震出版社，1999，95刘庆昌,吴国良
15、主编.植物细胞组织培养.北京:中国农业大学出版社，2002，47:486罗立新，潘力，郑穗平编著.细胞工程.广州：华南理工大学出版社，2003，217许智宏主编植物生物技术上海：上海科学技术出版社，1998,194:1958陈文祥、桂耀林、杨斧编著神奇的植物世界北京：中国农业出版社，1994，76:779薛庆善主编.体外培养的原理与技术.北京:科学出版社，2001，1069:107110叶庆华、曾定、陈振瑞编著.植物生物学.厦门:厦门大学出版社,2002,9,实验1 植物组织培养基母液的配制,1.1 实验目的,掌握植物组织、细胞培养中所需各种成分；熟练掌握培养基母液的配制方法。,1.2实验原理
16、,培养基组成成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化,在离体培养条件下，植物组织、细胞的生长发育仍然需要营养成分/生长调节物质,为工作方便起见，常用培养基通常先按配方配制成浓度高于实际使用浓度若干倍的母液，使用时按比例稀释即可,1.3 实验用品及试剂,1.4实验内容,首先按配方表，将各种组分根据各自的扩大倍数，计算出扩大后的称取量,分别称取药品,溶解、定容,标记、保存,清洗培养瓶,每组配制大量元素母液/微量元素母液/铁盐母液/有机附加物母液,每组配制1种植物生长调节物质母液,1.5实验注意事项,1）称量要精确。注意试剂的水分子数。公用试剂瓶的瓶塞要随开随盖，不要混淆药勺和试剂内外盖。,2）配制母液时要注意药品溶解的先后顺序，以免发生化学反应产生沉淀。,3）配好的母液需贮存于24的冰箱中，使用时再稀释。定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。,4）配制的各母液需贴上标签，注明名称、浓度、配制日期、班级、组别。,5）清洗6个果酱瓶/人，为下次实验做准备。,实验报告与思考题,
