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1、动物胚胎移植技术,郑州牧业工程高等专科学校 主讲人：张长兴,动物繁殖新技术系列讲座,目录,第一节 胚胎工程概述第二节 胚胎移植的原理第三节 胚胎移植的技术程序第四节 牛的胚胎移植,动物繁殖新技术系列讲座,第一节 胚胎移植概述,1.胚胎移植的历史2.胚胎移植技术的应用3.胚胎移植的成本4.胚胎移植的经济效益,动物胚胎移植技术,1.胚胎移植的历史,胚胎移植概述,1.1初始阶段：1890-1900 W.Heape将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只。,胚胎移植的历史,1.2初级阶段：1900-1950 主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%
2、左右。,胚胎移植的历史,1.3发展阶段：1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手术法移植成功。胚胎移植成功率达70-80%,胚胎移植的历史,1.4实用化初始阶段：1970-1980 加美开始成立牛胚胎移植公司，1973年牛冻胚移植成功（英）,胚胎移植的历史,1.5实用化研究阶段：1982-大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。,胚胎移植的历史,2.胚胎移植的应用范围,在家畜改良方面的应用在特定品种扩繁上的应用在动物生物多样性上的应用其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外受精,胚胎移植概述,2.1在家畜改良方面的应
3、用,人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀种公畜的配种效能。但对优秀母畜来说，受其产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力较低的畜种更是如此。通过超数排卵和胚胎移植技术（multiple ovulation and embryo transfer:MOET)牛羊的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高80%和70%；产奶性状提高33%。,胚胎移植的应用范围,2.2在特定品种扩繁上的应用,牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种群体需要7-8个世代，15-20年。而采用MEOT法，一次就可获得一个纯种群体80年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉牛品种均采用胚胎移植技术扩繁2000年前后，我国的波
4、尔山羊也是采用胚胎移植进行扩繁的,胚胎移植的应用范围,2.3在动物生物多样性上的应用,在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越越来发挥出重要作用。冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或生殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也是这种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验，并取得一些成功。如斑马胚胎移植给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛。,胚胎移植的应用范围,2.4其它方面应用,胚胎移植是克隆技术的必须过程体外受精必须借助胚胎移植实现“试管婴儿的继续发育转基因及动物生物反应器的研究也必须借助胚胎移植,胚胎移
5、植的应用范围,3.胚胎移植的成本,种母畜购入或培育成本及饲养费，胚胎成本分摊配种费激素：FSH、LH、PG手术费：手术药品及耗材、手术辅助人员报酬等技术费：技术人员约定报酬其它：实验室配置、差旅费、招待费,胚胎移植概述,4.胚胎移植的经济效益,胚胎移植是一个技术过程复杂，各个环节环环相扣，任何一个不能出现失误的系统工程。影响胚胎移植成功率的因素很多，同时，其运作成本较高。这使其应用中存在经济效益上的高风险性。如果不是基于急需扩群、供体高经济价值、育种目的，一般尽量采用自然繁殖。在特殊情况下，如供种初始阶段，少量优秀个体的扩增，胚胎移植可创造较好的经济效益。,胚胎移植概述,第二节 胚胎移植的生理
6、基础及原则,1.胚胎移植的生理学基础2.胚胎移植的基本原则,动物胚胎移植技术,1.胚胎移植的生理学基础,成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十数个每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育早期胚胎处于游离状态胚胎发育不存在免疫问题胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组联系胚胎的遗传性不受受体的影响,胚胎移植的生理基础及原则,2.胚胎移植的基本原则,胚胎移植前后所处的环境的同一性供体和受体在分类学上的相同属性动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内胚胎的质量：胚胎必须
7、是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响,至目录,胚胎移植的生理基础及原则,第三节 胚胎移植的技术程序,1.供体和受体的选择2.超数排卵处理3.供体母畜的配种4.胚胎的收集5.胚胎的检查6.胚胎的保存与培养7.胚胎的移植8.供体和受体的术后观察,动物胚胎移植技术,1.供体和受体的选择,供体应具有相当高的育种价值供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种受体健康状况良好，已进入发情季节供受体发情时间应接近或一致,胚胎移植的技术程序,2.超数排卵处理,意义：让每个供体提供更多的胚胎处理时间：牛：预计自然
8、发情时间的前4天，或发情周期的第16-17天羊：发情周期的第12-15天，促性腺激素处理的第二天或第三天，注射PG,胚胎移植的技术程序,3.供体母畜的配种,必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束配种前应对种公畜的精液进行质量检查可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精,胚胎移植的技术程序,4.胚胎的收集,胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布林斯特液SOF合成输卵管液手术法收集胚胎输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚子宫角冲胚非手术法收集胚胎二路法三路法,胚胎移植的技术程序,收集到的冲洗液静置，冲洗液分离拣胚：将胚胎移
9、至培养液或保存液中胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别,胚胎移植的技术程序,5.胚胎的检查,胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其体外生存时间体外培养：将胚胎置于体温条件下，在培养液中，使其继续发育胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胎降温冷冻后，保存于液氮中,胚胎移植的技术程序,6.胚胎的保存,手术法移植非手术法移植,胚胎移植的技术程序,7.胚胎移植,供体和受体的抗炎处理健康状况检查返情状况检查妊娠检查及妊娠确定,胚胎移植的技术程序,8.供体和受体的术后观察及处理,动物胚胎移植技术,第四节 牛的胚胎移植,一、供体牛的选择二、供体牛的饲养三、超数排卵处理四、采卵
10、,五、检卵六、胚胎的鉴定和分级七、胚胎的移植八、妊娠诊断,1.应符合本品种标准，具有较高的生产性能。8岁，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常。3.产犊记录清楚，无流产史，产后有两次正常发情记录。4.生殖器官正常，无繁殖疾病。5.重复超数排卵间隔60d左右。最多连续处理4次后，自然繁殖后再使用。凡2次超数排卵反应差的母牛不再用作供体。6.供体牛的超数排卵处理应在情期的第913d进行。凡黄体发育不良，卵巢静止的母牛不宜用。7.应选择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。,牛的胚胎移植,一、供体牛的选择,牛的胚胎移植,二、供体牛的饲养管理,1.良好的营养状况:要保证给供体牛足够的优质干草、青贮或多汁饲
11、料、精料以及维生素和矿物质，并供给清洁的饮水和盐，做到合理饲养，精心管理。2供体牛在采卵前后要特别注意保持良好的饲管环境，不得任意变换饲草；饲料和管理程序，避免因过强的应激所造成的神经紧张状态。,三、超数排卵处理,牛的胚胎移植,1.FSH法,促卵泡素(FSH)减量注射法：供体牛在发情后的9 13d肌注FSH，早晚各一次，间隔12h，分4d减量注射。在第3d时同时宫注PGF22.02.4mg或氯前列烯醇0.6mg。如使用国产FSH总剂量为325单位时，处理方法如附图所示。超排剂量根据不同厂家激素确定适宜剂量，国产激素320360单位，进口激素2836mg。,超数排卵处理,（三）采卵,激素的选择与
12、鉴定,牛超数排卵示意图,超数排卵处理,2.PMSG法,孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法在情期的1112d，一次肌注PMSG250030001U，48h后宫注PGF22.4mg。发情后约18h肌注等量的抗PMSG。,超数排卵处理,3.发情观察和配种,PGF2处理后4048h，大部分处理牛发情。通常要求从注PG第2d傍晚开始观察发情，至少早晚各观察一次。在观察到接受爬跨后46h进行第一次输精，间隔12h后第二次输精。每次有效精子数不得少于50106，输入两侧子宫角或子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。,超数排卵处理,四、采卵,牛的胚胎移植,1采卵时间,以发情日为第0d，在第56d检查卵巢确定黄体数
13、，以便于安排受体头数。第7d(或第68d)非手术回收卵。,采卵,2器械和冲卵液的准备,灭菌处理过的冲卵管用PBS液冲洗23次，插入钢芯，检查气球。在无菌间用导管连接吊瓶和集卵杯灌流装置。装入PBS液的吊瓶在37水浴中预温待用。准备好必要的麻醉剂、注射器、酒精棉球和冲洗消毒剂等。,采卵,3供体牛的保定和麻醉,供体牛保定完毕后，在第一、二尾椎骨间酒精消毒，用2%普鲁卡因35ml作硬膜外麻醉，或肌注2%静松灵l ml。,（三）采卵,采卵,4外阴清洗、消毒,麻醉后将牛尾竖直绑在保定架上，清除粪便，用清水冲洗会阴部及外阴，再用高锰酸钾液冲洗消毒，用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。,采卵,5冲卵
14、管的插入和冲卵部位,助手将准备好的冲卵管交给术者的右手，术者左手食指和拇指压开阴门插入冲卵管，再将左手伸入直肠，仔细小心地诱导冲卵管经子宫颈进入一侧子宫角至大弯处，抽出少许钢芯，再将冲卵管向前推，使其尖端靠近子宫角深部。由助手持30ml注射器一次推入10ml空气，然后按术者要求，以1ml计数充气。根据子宫大小及冲卵管在子宫的位置确定充气量，一般青年牛充气1416ml，经产牛为1825ml。冲卵管固定后抽出钢芯，开始灌流。,（三）采卵,采卵,6灌流方法,将吊瓶挂在距外阴部1.0m高处，接通三通管(Y型)和冲卵管。术者用右手控制进流和出流开关，每次灌注3050ml，由少到多，每侧总量为300500
15、ml。左手通过直肠辅助按摩子宫角。每侧子宫角冲810次。或者用50ml注射器，每次注入3050ml的PBS冲卵液，分次冲洗子宫角，回收后注入加盖量筒。另一侧子宫角的冲洗是由术者右手拉直冲卵管，助手小心插入钢芯。术者的左手在直肠内诱导钢芯插稳后，给气球放气。术者再将冲卵管插入另一侧子宫角，用同样的方法冲洗。全过程需在室温(20左右)操作。,（三）采卵,采卵,（三）采卵,采卵,7术后处理,两侧子宫角冲卵完成后，从气球放出一部分空气，将冲卵管抽至子宫体灌注土霉素溶液(3g土霉素粉溶于100ml灭菌双蒸水或生理盐水)或10ml青霉素(80万u)和链霉素(100万u)，拔出冲卵管。,（三）采卵,采卵,五
16、、检卵,（三）采卵,1过滤集卵杯(日本产)法,回收结束后，用带4G针头的注射器冲洗滤网23次，吸去杯中的泡沫，置实体显微镜下检查。,（三）采卵,检卵,2过滤杯(美国产)法,滤去冲卵液，将过滤杯中留下的3050ml倒入平皿，用冲卵液冲洗过滤杯23次，一并倒入平皿，置镜下检查。,（三）采卵,检卵,3沉淀法(或滤网吸液法),将回收的冲卵液注入1000ml量筒，在2025下静置2030min(min)，用导管吸去上层液体。或者按好滤网，用导管在滤网上吸去上部冲卵液，将残留的80100ml倒入平皿内检卵。,（三）采卵,检卵,4检卵前的准备,在酒精灯上拉好内径为200300um的玻璃吸管和玻璃棒，在吸管上
17、连接乳胶管(也可用1ml一次性注射器与一支采血管接一起)。在小培养皿内做好含10%或20%牛血清的PBS保存液液滴35个，覆盖上液体石蜡油，作好编号，放入培养箱待用。,（三）采卵,检卵,5检卵,用玻璃棒清除卵外围的粘液、杂质。用吸管将卵移至培养皿的液滴内，同一供体牛的卵放于同一液滴内。然后用吸管先吸入少量第二液滴的PBS保存液至第一液滴，吸入全部卵，防止吸入黏液、杂质，移至第二液滴，依次冲洗卵35次。室温2025，需2人进行检卵及胚胎鉴定。,（三）采卵,检卵,六、胚胎的鉴定和分级,胚胎的鉴定及分级,1胚胎的鉴定,（三）采卵,胚胎的鉴定及分级,在100200倍实体解剖镜下观察受精卵的形态、色调、
18、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等。凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的，均列为未受精卵。,（三）采卵,胚胎的鉴定及分级,二细胞至四细胞胚胎,（三）采卵,胚胎的鉴定及分级,胚胎的早期发育过程,胚胎的鉴定及分级,（三）采卵,胚胎的鉴定及分级,通常受精后68d非手术回收的正常受精卵发育情况如下：桑椹胚一发情后第56d回收的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球，占据透明带内腔的大部分。致密桑椹胚：发情后第67d回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔60%70%。,（三）采卵,胚胎的鉴定及分级,（三）采卵,早期囊胚：发情后第78d回收的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团
19、占透明带内腔70%80%，难以分清内细胞团和滋养层。囊胚：发情后第78d回收，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。扩大囊胚：发情后第89d回收，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的1.21.5倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/3。,胚胎的鉴定及分级,孵育胚：一般在发情后911d，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。凡在发情后第68d回收的16细胞以下的受精卵均应列为非正常发育卵，不能用于移植或冷冻保存,（三）采卵,胚胎的鉴定及分级,2胚胎的分级：,（三）采卵,胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度。如：发情后第7d回收的受精卵在正常发育时应
20、处于致密桑椹胚至囊胚阶段。凡在16细胞以下的受精卵及变性细胞超过一半的胚胎均属等外。,胚胎的鉴定及分级,A级胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。,（三）采卵,胚胎的鉴定及分级,B级 一轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡，变性细胞约占10%30%,（三）采卵,胚胎的鉴定及分级,C级 轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达30%50%。,（三）采卵,胚胎的鉴定及分级,（三）采卵,胚胎的鉴定及分级,塑料细管的编号：剪一段(2cm)0.5ml的塑料细管作为标记外套，内装色纸，写上供体品种、牛号
21、、胚胎发育阶段及等级、制作日期(年、月、日)，并在外套管上写明序号备查。,（三）采卵,3.胚胎的标记,七、胚胎的移植,（三）采卵,牛的胚胎移植,1受体牛的选择标准,年龄在38岁，健康，无疾病，体格较大，膘度好。繁殖性能正常，产后60d以上，并有两次以上的正常自然发情记录。泌乳性能好，无难产史。不使用两次人工授精未孕的牛。,（三）采卵,胚胎的移植,2受体牛的饲养管理,做到精心管理，合理饲养，环境清洁，饲草、饲料、饮水要新鲜，补充食盐和必要的添加剂。组成一定数量的牛群。圈舍内防止过挤，以便于发情观察。农户长期舍饲的母牛要注意加强运动。防止在移植前后因饲料及环境改变造成的应激反应。,（三）采卵,胚胎
22、的移植,3供体牛、受体牛的同期发情,自然发情根据受体牛的发情观察，与供体牛发情前后相差一天内的牛，可作为受体。,（三）采卵,胚胎的移植,使用PGF2。(一次宫注)诱发发情一般在供体牛注射PGF2前一天，给处于情期815d且直检黄体好的受体牛一次宫注PGF22mg诱发发情。两次PGF2处理在不考虑发情周期的情况下，可间隔11d，前后两次宫注PGF2受体牛的处理日程安排应与供体牛超排处理相吻合。,（三）采卵,胚胎的移植,4.发情观察,原则上根据母牛接受爬跨确认发情，早、晚各观察30min发情情况。对发情牛需做直检以确认卵泡，次日上午或晚上确定是否排卵。若在发情后36h以后排卵的牛不能用作受体。,（
23、三）采卵,胚胎的移植,供体牛、受体牛的发情日差移植胚胎时，如果供体和受体牛的发情周期不一致，则难以受胎。要求两者的子宫环境相一致。受体牛的发情日比供体牛早一天为+1，晚一天为-1，同日发情为0。超过2d不能用于移植。按胚胎发育情况选受体牛的发情日差可将致密桑椹胚移植给发情6d的受体牛，将早期囊胚移植给发情7d的受体牛，将囊胚和扩大囊胚移植给发情8d的受体牛。,（三）采卵,胚胎的移植,5.器械准备,仿西德式金属移植器，先将移植枪、枪头及金属保护外套分别用纸包扎好，高压消毒。塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。移植时，先用70%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料细管，然后剪掉封口一端，装入移植枪内，套上保护外套
24、。,（三）采卵,胚胎的移植,6.移植前胚胎装管,胚胎移植时可用0.25ml细管分三段吸入PBS保存液，中间由两个气泡隔开，中段含有胚胎。也可用小气泡分成多段装管，胚胎在中段。一步细管法解冻脱甘油后，用酒精棉球多次消毒细管，剪去封口即可用于移植。,（三）采卵,胚胎的移植,（三）采卵,胚胎装管示意图,胚胎的移植,7.受体牛的准备,将受体牛保定，清除粪便，肌注2%静松灵l ml或用2%的普鲁卡因3ml在1、2尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉球消毒。,（三）采卵,胚胎的移植,8.移植,术者用左手压开外阴，右手持移植器插入阴道。然后左手伸进直肠，移植器到达子宫
25、颈口时，右手用力将移植枪捅破外套填片，插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体侧子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。,（三）采卵,胚胎的移植,移胚,（三）采卵,胚胎的移植,八、妊娠诊断,（三）采卵,牛的胚胎移植,1直肠检查法,通常在移植后三个月开始检查。妊娠90d时，子宫继续增大，落入腹腔，可感觉到胎儿的浮动，孕角出现孕脉，子宫壁可触到子叶。,（三）采卵,妊娠诊断,2超声波诊断(B超),对妊娠25d以上的受体牛可用B超检查。利用探头通过直肠轻轻地在子宫角滑动，在荧光屏上便可观察到周围黑色中间有一个长12cm灰白色图像，即是胎儿。胎儿60日龄时为67cm长，90日龄时为1417cm长。使用B超探头检查时要特别注意，防止动作过重，检查过度，以免引起流产。,（三）采卵,妊娠诊断,（三）采卵,胚胎移植产出的犊牛,谢谢！The End,
