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1、1,第六章体外分析,皖南医学院弋矶山医院陶绍能,2,定义,体外分析以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。,3,放射分析方法或其派生的相关技术在体外进行机体内物质种类和含量的分析测定。测定对象是患者血清或其他体液样品内的激素、其它生物活性物质和药物浓度等。,4,体外放射分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、样品用量少、放射线不引入人体内、应用面广、方法简便等优点。是对多种疾病诊治和研究的重要方法之一。1959年由美国
2、 Berson&Yalow建立了本方法，Yalow为此在1977年获得诺贝尔医学与生理学奖,5,体外分析技术建立的基础:,以配体和结合体的特异性结合反应为共同的生物学基础以结合反应动力学规律作为共同的方法学基础以放射性等的测量技术作为共同的定量手段,6,生物学基础：特异性结合反应,配体-结合体 抗原-抗体的免疫结合反应；配基-受体的结合反应；底物-催化酶之间的酶促反应；激素-激素结合球蛋白的结合反应,7,方法学基础：结合反应动力学规律,遵守可逆反应的质量作用定律：k1,v1L+R RL k2,v2,8,定量手段(标记配体作为示踪剂),放射性测量技术酶定量技术化学发光定量技术荧光定量技术,9,体
3、外分析技术,体外放射分析,体外非放射分析,放射性竞争结合分析,放射性非竞争结合分析,放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA),免疫放射分析,酶免疫分析,化学发光免疫分析,荧光免疫分析,(immunoradiometric assay,IRMA),(EIA),(CLIA),(FIA),分类:,10,放射免疫分析radioimmunoassay,RIA,11,放射免疫分析法是Yalow和Berson于1959年在研究胰岛素的时候创立的一种体外放射分析技术。结合了放射性核素的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性。,Dr.Yalow,12,一、RIA的基本原理,（一）竞争抑制结合反应：放射
4、免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原（*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞争抑制结合反应。,Ag和*Ag Ab间呈负相关函数关系,13,基本原理,Ag-Ab+Ag,*Ag,Ab,Ag,+,+,*Ag-Ab+*Ag,(B),(F),*Ag与Ag 免疫活性相同*AgAg Ab,Ag=*Ag,AgAb=*AgAb,Ag*Ag,*AgAb(B)*Ag(F),Ag*Ag,*AgAb(B)*Ag(F),14,Ag,*Ag,Ab,*AgAb,AgAb,*Ag,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,Ag,15,（二）剂量反应曲线：标
5、准曲线,标记物与被测物之间的函数关系可以用剂量反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准曲线。标准抗原(标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知剂量的非标记抗原。,16,标准曲线的绘制方法,用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应；在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F；分别测量B和F的放射性；用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是剂量反应曲线。,17,Ag,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,
6、分离B、F,B%=B/(B+F),F%=F/(B+F),R=B/F,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,浓度,18,B%,标 准 曲 线,19,未知样品的测量,在同等条件下，用待测抗原与一定量的标记抗原与限量特异性抗体发生反应，并用同样的方法分离待测抗原的B和F，测量其放射性，计算出B/F，在剂量反应曲线上就可以查出对应的抗原浓度。,20,Ag,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,分离B、F,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,B%,？,21,B%,F%,B/F,Calibration Curve,6
7、0,22,在实际的操作中，一般要设立：最大结合管（Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。,23,总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总放射性。标准管（B1Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原
8、和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为B。样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。,24,选用不同的反应变量作纵坐标，标准曲线的形状也不同。常用的有B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B等。,25,标准曲线左：横座标为等份刻度；右：横座标为对数刻度,26,（一）标准抗原,是厂家给出已知剂量的非标记抗原。一般每一个RIA试剂盒里都有浓度由小到大的多瓶标准抗原。,二、RIA基本试剂,27,标准抗原的要求：,1、标准抗原与待测抗原、标记抗原具有基本相同的免疫活性，即质同。他们的化
9、学结构和化学性质要相同，对特异性抗体的亲和力要相同。并且，标准抗原与待测抗原所处的介质条件要相同。,28,2、定量要准确：整个RIA分析系统的定量基础就是标准抗原的量，因此标准抗原的定量一定要准确，即与国家规定的标准品相比有良好的可比性。只有保证标准抗原的准确定量，才能保证RIA分析系统的准确度和精确度。,29,3、必须高纯度：标准抗原应该含有尽可能少的化学杂质，以避免杂质对反应和计量的影响。4、稳定性要好：要保证在试剂盒的运输、储存和在实验过程中应该不发生降解，分离、破坏等。,30,1）比活度和放化纯度足够高,比活度每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/g）,放化纯度具有免疫活性的标
10、记抗原占总放射性的百分数。90%,2）半衰期足够长,3）保持原有抗原的特性,大分子：125I小分子：3H or 125I,（二）标记抗原,31,标记抗原的要求,1、质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质和免疫活性要相同。2、标记抗原要有适当高的放射性比活度。比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。但过高的比活度，也会引起诸如辐射自分解和免疫活性受损的问题。,32,3、标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大于95%。放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对RIA的免疫反应和动力学
11、参数产生影响。由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗原一般要经过重新提纯后才能再次使用。,33,4、标记抗原的稳定性要好：和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素射线的影响，更容易发生分解。在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。,34,（三）特异性抗体,包括多克隆抗体和单克隆抗体。抗体的质量之间关系到RIA分析方法的灵敏度和特异性。,35,抗体的要求（三高）,高亲和力高特异性高滴度,36,抗体的检测指标,1、亲和常数K（affinity constant）：亲和常数反应了抗体与抗原的亲和力。K值越大，形成抗体抗原复合物速度快，解离少，灵
12、敏度高，准确度和精确度都好。K=结合常数k1/解离常数k2。,37,2、交叉反应率：指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的特异性。在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似的类似物，例如甲状腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。,38,常用50%置换法来测定交叉反应的百分率。即将被测物质和其类似物，分别作竞争抑制曲线，比较两者在其结合率为零管（B/B0）的50%时的剂量响应浓度，其比值即为交叉反应百分率，也就是该抗体对被测物某种类似物的相应活力。,39,3
13、、滴度：又称稀释度，反映了抗血清中有效抗体的浓度。指在没有标准抗原存在的时候，结合50%的标记抗原时抗血清的稀释度。其方法就是用缓冲液将抗血清稀释为不同的浓度，各置于试管中，然后各加一定量的标记抗原进行反应，等到反应平衡后分离B和F，测出B的放射性，算出B%，以B%为纵坐标以抗血清的稀释度为横坐标作出抗血清稀释曲线，B%为50%所对应的抗血清滴度为工作滴度。,40,三、RIA的分离方法,指分离标记抗原抗体复合物（B）和游离标记抗原（F）的方法。根据使用的分离剂不同可以分为：非特异性分离方法：利用物理、化学或生物化学的方法如吸附、过滤、沉淀等。特异性分离方法：利用免疫反应的特异性来进行分离的方法
14、如双抗体法等。,41,（一）分离方法的要求,分离完全、快速。不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。受环境因素（温度、PH值等）的影响小。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。,42,（二）非特异性分离方法,1、吸附法：利用表面活性物质将反应液中的中小分子，即游离部分F吸附，离心后将大分子B留在上清夜中达到分离的目的。常用的表面活性物质是葡聚糖凝胶和活性碳颗粒。,43,2、过滤法：用一定规格孔径的滤膜过滤，大分子不能通过而留在滤膜上，达到分离的目的。常用0.22m的醋酸纤维薄膜。,44,3、沉淀法：在溶液中，大分子的标记抗原抗体复合物由一层水分子膜所包被，
15、使其能够溶解在溶液里。在溶液中加入一定量的沉淀剂如聚乙二醇，乙醇等可以破坏大分子的水包膜，使大分子互相靠拢，形成更大的分子而沉淀下来。,45,（三）特异性分离方法,1、双抗体法：用待测抗原的抗体（第一抗体，Ab1）作为抗原去免疫另一种属的动物而产生新的抗体（第二抗体，Ab2），Ab2 可以和Ab1特异性结合而形成更大的Ag-Ab1-Ab2三联复合物而沉淀。此法特异、高效、非特异结合低、重复性好。,46,2、固相法：将第二抗体用一定的方法涂在试管等容器的内壁上，然后直接在试管内进行反应，平衡后抗原抗体复合物连接在试管壁上，直接将上清液倒掉后就可以测定试管的放射性，十分方便。,47,3、磁性微粒分
16、离技术,是一种新兴的分离技术。磁性微粒是用高分子材料和金属离子如Fe3O4为原料，聚合而成的一种以金属离子为核心，外层则均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。,48,使用时磁性微粒经过特异性抗体包被制成的免疫磁性微粒以悬浮液状态存在于反应溶液中，在反应中与抗原结合形成复合体后，当受外加磁场吸引的作用磁性微粒可快速沉降而自行分离，无需离心沉淀，因而使操作过程大为简化。,49,磁化分离技术的突出优点是：（1）非特异结合率低；（2）磁化固相颗粒在反应系统呈悬浮状态，便于和抗原结合，缩短了反应平衡时间；（3）磁化颗粒表面积大，制成的固相抗体可含较多的抗体量；（4）利用磁性分离架，不用抽吸，分离完全，操作简
17、便。,50,四、测量仪器,1.射线探测器（免疫计数器）：射线2.液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)：射线,51,五、RIA的优点,1、灵敏度高：一般化学分析法的检出极限为10-310-6g，而RIA通常为10-9(ng)、10-12(pg)，甚至10-15(fg)、10-18(ag),52,2、特异性强：RIA是基于抗原抗体免疫结合反应，由于抗原抗体免疫反应专一性强。良好的特异性抗体，能识别化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异构体。被测物-抗原,53,3、应用范围广：据不完全统计，目前至少已有300多种生物活性物质已建立了RIA。它几乎能应用于所有
18、激素的分析（包括多肽类和固醇类激素），还能用于各种蛋白质、肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原以及一些小分子物质（如环型核苷酸等）和药物（如地高辛、毛地黄甙等）的分析。近年来由于小分子半抗原制备抗体的技术有很大的发展，有人预测几乎所有的生物活性物质，只要其含量不低于RIA的探测极限，都可建立适当的RIA法。,54,4、操作简便，商品化程度高：RIA所需试剂品种不多，便于制成配套试剂盒；加样程序简单,一次能分析大量标本；反应时间不长；测量和数据处理易于实现自动化；RIA属体外分析技术，对患者无任何辐射危害。操作简便，成本低。血清、血浆、体液、组织匀浆等样品不加提纯就可直接测量。,55,六、R
19、IA的质量控制,一个理想的、没有误差的“完美”测定，应该是标本样品的分析物无论是在一次测定中的任何位置，无论是重复测定几次，甚至在不同实验室所测得的结果都是一样的，而且所测值就是这个样品的真值。但是，在实际工作中，这种理想的测定是不可能达到的。任何一种分析方法都会产生误差。,56,一个完善的质量控制体系应包括两个环节：1、生产厂家应该建立严格的质量检测程序。2、实验室应该有严格的质量控制体系。包括实验室内部质量控制（室内质控）和实验室间的质量控制（室间质控）。,57,（一）误差的分类和来源：,根据来源不同的误差，可以把实验中产生的误差分为两类：系统误差随机误差,58,1、系统误差：是由于试剂、
20、仪器或操作方法上一个固定的缺陷而造成整批结果倾向性的偏差，影响了结果的正确性。系统误差引起的测定结果的偏差是固定的偏大或偏小。系统误差是可以避免的。,59,2、随机误差：是由于实验过程中各种偶然因素造成同一样品多次测定的结果不一致。误差的出现是随机的，与真实值的偏离是双向性的，可大可小。随机误差无法避免。,60,（二）质量控制,质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。具体作用有：1检查误差的程度，决定测定结果的取舍。2识别误差的来源并消除其原因。3改进测定方法的设计以提高质量。,61,（三）RIA质量控制指标,包括实验室内部质量
21、控制和实验室间的质量控制。实验室内部的质量控制侧重于对检测质量的控制，保证从样品收集到发出结果报告的整个过程中能及时发现各种误差，并分析原因，找出纠正的方法。质量控制的指标包括：精密度、准确度、灵敏度、特异性、稳定性,62,1、精密度（precision）：精密度是指在一定条件下，同一实验方法对同一样品多次重复测定所得到的结果之间的离散程度，即结果的一致性。主要反映随机误差的大小。主要用变异系数或绘制精密度图的方法来评价。,63,2、准确度（accuracy）：是指测量值与真值的符合程度，其偏离真值的误差就叫做偏差。在实际工作中我们用设置质控样品、测定回收率或进行健全性评价的方法来判断准确度。
22、,64,（1）质量控制样品质量控制样品是含有已知剂量待测物的血清样本。质控样品和待测样品为同一种物质，具有相同的生物和免疫活性。质控样品的浓度应准确定量并有合理的浓度范围。通常是根据待测物在人体血清内的正常浓度制定高、中、低三个剂量水平的质控样品。使用时将质控样品分置在待测样品的不同位置中同时检测。,65,（2）回收率的测定：设置回收管和对照管，在对照管中加入待测样品，回收管中加入等量待测样品和已知量的分析物，经过反应后计算其回收率。一般的回收率的要求是90110。,66,（3）健全性评价：主要用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一致。用反应缓冲液将样品稀释成不同的剂量，绘制样品稀释曲线，如
23、果样品与标准品免疫活性相同，得到的曲线应该是一组平行的曲线，所以又称为平行性实验。,67,3、灵敏度（sensitivity）：是指RIA方法刚能与不含有标准抗原的零标准管在统计学上区别开来的抗原最低剂量，即该RIA方法的最小可检测量。确定灵敏度的方法主要有：同一样品10次测量结果的B/B090的剂量的平均值作为最小可测量。以10次测量结果的B0管结合率均值减去2SD（标准差）的结合率的剂量对应值为最小可测量。,68,4、特异性：方法的特异性主要取决于抗体的特异性。用抗体的交叉反应率来表示。5、稳定性：测量结果的稳定性可以通过剂量反应曲线的各个参数的稳定性来间接反映。如标准曲线的斜率和截距，零
24、标准管结合率的75%、50%、25%处的剂量值(ED75、ED50、ED25等)。,69,七、RIA的方法学,（一）反应方式：1、平衡加样法：也称一步法，是将非标记抗原、标记抗原和抗体同时加入反应体系进行反应。优点：使非标记抗原、标记抗原两者与抗体有相同的反应几率，操作方便，精密度较好，稳定性好。缺点：反应时间长，灵敏度较差,70,2、顺序加样法：先将非标记抗原与抗体温育反应一定时间（624小时），形成抗原抗体复合物后，然后再加入标记抗原短时间（14小时）温育后中止反应。优点：使非标记抗原与抗体结合的几率比标记抗原高，提高了非标记抗原的竞争能力，提高了方法的灵敏度。,71,（二）反应介质：1、
25、缓冲液：(pH值：7.47.8)缓冲液为RIA提供一个适合的反应环境，是RIA成败的关键。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液，Tris-HCL缓冲液等。2、离子强度：0.050.1mol/l离子强度过高会抑制抗原抗体反应，过低会降低缓冲能力，引起反应系统PH值的变化，同样会影响抗原抗体反应。,72,3、添加剂：0.5牛血清白蛋白：减少反应试管对微量抗原、抗体的吸附。0.01mol/l EDTA钠盐：多功能的螯合剂，可以去除样品中的钙镁离子。0.05叠氮钠：防腐剂。,73,（三）反应的温度和时间,温度升高，抗原抗体结合的亲和力要下降，温度每升高10，抗原抗体结合达到平衡的速度约提高一倍，达到平衡的时间缩
26、短，反应时间缩短。温度降低，亲和常数提高，增加了反应的灵敏度。,74,（四）操作基本步骤,RIA的操作一般包括加样、孵育、分离、测量和数据处理5个部分。加样：注意所有的试管加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37。分离：选择好的分离方法进行分离。测量：测量游离或结合物部分的放射性。数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。,75,免疫放射分析,immunoradiometric assay,IRMA,76,*Ab,+,Ag-*Ab+*Ab,Ag,（B）,（F）,在体外条件下,利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性复
27、合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分析技术。,基本原理,77,基本原理,免疫放射分析是一种非竞争性的抗原抗体反应，是用过量的放射性标记抗体来测定样品中的抗原，其中标记抗体是过量的，抗原全部是非标记的。将放射性核素标记在抗体上，用过量的抗体与抗原结合，反应平衡后，用分离方法除去多余的抗体，测量抗原-标记抗体复合物的放射性。利用抗原-标记抗体复合物的放射性活度与抗原剂量之间的函数关系来测定待测抗原的量。,78,IRMA的基本方法,根据IRMA的分离方法一般可以分为：1、双抗夹心法:（最常用）将分离抗体涂在反应容器的壁上，称固相抗体。固相抗体先于抗原反应，形成固相抗体抗原复合物，再与标记抗体反应，
28、形成固相抗体抗原标记抗体复合物附着在管壁上，倾去上清液直接测量反应容器的放射性。,79,80,2、标记第三抗体法：用双抗夹心法中的第二抗体（标记抗体）作为抗原免疫其他的动物获得的抗体为第三抗体。反应后得到固相抗体抗原第二抗体标记第三抗体的复合物。一般第三抗体是由兔抗鼠IgG的抗血清制成的，对于所有使用小鼠IgG作为第二抗体的反应系统都能形成抗原抗体复合物，又称为通用性标记抗体。,81,3、生物素亲和素系统：一个抗体分子可以连接多个生物素分子，而每一个生物素分子都可以连接一个亲和素且连接很紧密。用放射性核素标记亲和素，可以使这个IRMA系统的灵敏度大大提高。,82,IRMA和RIA的区别,1、反
29、应机制不同：RIA是竞争性反应；IRMA是非竞争性反应2、反应试剂：RIA主要试剂有三种，标记的是抗原；IRMA主要试剂只有两种，标记的是抗体。,83,3、分离方法不同：IRMA需要2个或2个以上的抗原决定簇；RIA只需要一个抗原决定簇。4、剂量关系：待测抗原复合物的放射性在RIA中于待测抗原的量呈负相关；在IRMA中呈正相关。,84,5、反应中的NSB：在RIA主要影响高剂量反应；在IRMA中主要影响低剂量反应。,拟合的标准曲线,拟合的NSB,拟合的标准曲线,拟合的NSB,IRMA的标准曲线及非特异结合曲线,RIA的标准曲线及非特异结合曲线,85,IRMA与RIA工作原理的主要区别,86,I
30、RMA在实际应用中的特点,标记物的稳定性好：标记的是抗体IgG蛋白分子，含有多个酪氨酸或组氨酸残基，标记方法简单，稳定性好。反应动力学：非竞争性反应，且抗体是过量的，反应速度快，反应容易达到平衡，温度变化对结果影响不大。,87,灵敏度：理论上比RIA高出10100倍。但是要求有良好的分离方法的保证。特异性：由于使用的是单克隆抗体，所以特异性一般比较高。加样误差：由于抗体是过量的，所以在IRMA的加样误差主要来自抗原一个环节。而RIA的抗体、待测抗原、标记抗原都可能产生加样误差。,88,优点：是非竞争性反应，灵敏度明显高于RIA。缺点：需要特殊的分离方法。由于IRMA中要分离的是游离抗体和抗原抗体复合物，都属于大分子，非特异的分离方法很难奏效。主要是靠单克隆抗体作为分离剂，因此在IRMA系统中需要两种抗体，至少需要两个抗原决定簇，对小分子的半抗原不合适。,
