今幸胶囊对甲氨蝶呤所致肾损伤及免疫低下小鼠的免疫调控作用.docx

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1、今幸胶囊对甲氨蝶吟所致肾损伤及免疫低下小鼠的免疫调控作用1材料与方法1.1样品今幸胶囊由浙江亚克药业有限公司提供（样品批号：170601），内容物为类白色颗粒，感官 检查未见异常。1.2实验动物C57BL/6J雄性小鼠，6周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，饲养于华中科 技大学同济医学院无特定病原体（SPF）级实验动物中心，适应性喂养一周后用于实验。1.3主要药品、试剂胸腺五肽、甲氨蝶吟、RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗（青霉素、链霉素）、LPS、ConA、 MTT、APC标记抗小鼠CD11b抗体、PE标记抗小鼠Gr-1抗体、PE-Cy5标记抗小鼠CD3抗 体、PE标记抗小鼠

2、NK1. 1抗体、PE标记抗小鼠F4/80抗体、PE标记抗小鼠PD-1抗体、 FITC标记抗小鼠CD4抗体、PE标记抗小鼠CD8抗体、PE标记抗小鼠CD25抗体、PE标 记抗小鼠F4/80抗体、PE-Cy5标记抗小鼠Foxp3抗体、FITC标记抗小鼠CD11c抗体、PE标 记抗小鼠MHCII抗体、APC标记抗小鼠CD86抗体、PE标记抗小鼠TCR-。抗体、PE标记 抗小鼠 PD-L1 抗体、rmGM-CSF、rmIL-4、Mouse IL-6、IL-10、IL-12、IL-2、IFN-丫、TNF-a ELISA试剂盒、ALT、AST检测试剂盒、CRE、BUN检测试剂盒。1.5主要仪器超净工作台

3、、CO2培养箱、荧光倒置显微镜、高速冷冻离心机、超纯水机、电子天平、流式 细胞仪、恒温振荡器、压力蒸汽灭菌锅、4C、-20C、-80C冰箱、低速离心机、多功能酶 标仪、电热鼓风干燥箱。1.6实验方法1.6.1甲氨蝶吟所致肾损伤及免疫低下小鼠模型的建立甲氨蝶吟为抗代谢疗法药物，可用于抗肿瘤、白血病、风湿，或预防移植排斥反应。大剂量 对肝肾功能会造成损害，减弱机体的免疫功能1-3。C57BL/6J小鼠适应性喂养一周后，隔 天给予甲氨蝶吟（8mg/kg）,腹腔注射，连续两周，建立甲氨蝶吟所致肾损伤及免疫低下小 鼠模型。1.6.2试验分组和给药方法（空白组10只，其他组每组15只）Control （K

4、）组：正常小鼠每天灌胃生理盐水0.2ml/只。Model （M）组：小鼠每天灌胃生理盐水0.2ml/只。胸腺五肽（TP-5）组：每天腹腔注射TP-5 0.1mg/kg，给药两周。今幸胶囊（Jinxing）高剂量组：每天灌胃Jinxing 30mg/kg，给药两周。今幸胶囊（Jinxing）中剂量组：每天灌胃Jinxing 20mg/kg，给药两周。今幸胶囊（Jinxing）低剂量组：每天灌胃Jinxing 10mg/kg，给药两周。每天观察小鼠活动及毛皮颜色等。末次给药后，小鼠经眼眶取血后，颈椎脱臼处死，取胸腺、淋巴结、脾脏、肝脏、内脏脂肪称重。分离脾脏、胸腺和淋巴结淋巴细胞 以及骨髓来源的D

5、C测定相关指标。1.6.3脾、胸腺、淋巴结细胞悬液制备无菌条件下迅速取出脾脏，取部分脾组织制备脾淋巴细胞。将脾脏组织放入约含5ml无菌 PBS的培养皿内，清洗三次，用胶头滴管研磨脾脏，经100目尼龙筛网过滤，收集细胞悬 液于离心管中。1200rmirr1离心五分钟，加入红细胞裂解液1ml ,1700rmin-1离心五 分钟，再用无菌PBS洗涤细胞三遍，用RPMI-1640培养基重悬细胞。于倒置显微镜下细胞 计数，细胞活力测定需90%，并调整细胞浓度为2*107个/ml。（胸腺、淋巴结细胞悬液制 备方法相同）1.6.4脾T、B淋巴细胞增殖取上述脾细胞悬液适量稀释为3*106个/ml,0.1ml接

6、种于96孔板，每份样品设3个复孔， 另加100|1L ConA（5|ig/mL）或100|1L LPS（10|ig/ml）分别刺激T、B淋巴细胞增殖，同时设 置相应对照孔37C5%CO2培养箱中培养24h后，每孔加入20ul MTT（5|ig/mL），轻轻振摇 后继续培养4h。取出培养板3000rmin-1离心15min，弃掉上清，每孔加入150|1L DMSO充 分溶解甲瓒，于490nm和570nm处用酶标仪检测OD值。1.6.5脾脏NK细胞、巨噬细胞、TCR、MDSC比例及PD-1测定取100|1L 1*107 个/ml PBS重悬的脾淋巴细胞悬液,NK细胞加入PE-Cy5标记的小鼠CD3

7、抗 体和PE标记的小鼠NK1. 1抗体；巨噬细胞加入APC标记的小鼠CD11b抗体和PE标记的 小鼠F4/80抗体；TCR加入PE-Cy5标记的小鼠CD3抗体和PE标记的小鼠TCR-。抗体； MDSC加入APC标记的小鼠CD11b抗体和PE标记的小鼠Gr-1抗体；PD-1加入PE-Cy5标 记的小鼠CD3抗体和PE标记的小鼠PD-1抗体,4C避光孵育1h,加入1ml PBS,1200rmin-1 离心5min，重复一次，用300|1L PBS重悬，上流式细胞仪检测细胞百分率。研磨脾脏、胸腺和淋巴结，分别制成1*107个/ml的细胞悬液备用，用PBS重悬。取100L 1*107个/ml脾脏、胸腺

8、细胞悬液，均加入PE-Cy5标记的小鼠CD3抗体、FITC标记的小 鼠CD4抗体、PE标记的小鼠CD8抗体，4C避光孵育1用加入1ml PBS, 1200rmin-1离 心5min，重复一次，用300|iL PBS重悬，上流式细胞仪检测细胞百分率。1.6.7 CD4+CD25+Foxp3+ Treg 测定取上述浓度为1*107/ml的脾脏、胸腺细胞悬液100|1L,按说明书加入FITC标记的小鼠CD4 抗体和PE标记的小鼠CD25抗体，混匀,4C避光孵育1h。用flowcytometry staining buffer 洗涤细胞两次,1200r-mir-1离心5min。每个样本加入fixati

9、on/permeabilization工作 液800|1L,4C避光反应1h。用permeabilization buffer洗涤细胞两次，每次1ml, 1700r-min-1 离心 5min100|iL permeabilization buffer 重悬细胞，加入 PE-Cy5 标记 的小鼠Foxp3抗体，4C避光反应1h。用permeabilizationbuffer洗涤细胞两次，每次 1ml ,1700r-min-1 离心 5min。300ul permeabilization buffer 重悬细胞，上流式细胞仪 检测。1.6.8 DCs的分离和培养取每只小鼠的胫骨和股骨，洗净并分离

10、骨髓，100目尼龙网过滤去除杂质，用无菌PBS清 洗后得到骨髓细胞悬液；加入1ml红细胞裂解液，避光反应2min，加3ml PBS终止，再用 3ml PBS清洗一遍，计数板计数，用RPMI-1640培养基调整细胞浓度约为2*106个/ml。取 2ml细胞悬液加入6孔培养板中，再加入rmGM-CSF (20ng/ml)和rmIL-4 (10ng/ml)细胞 因子后在37C, 5%CO2培养箱中培养。每两天半换液，并在倒置显微镜下观察细胞形态、 生长情况及集落的数量和大小。第七天收集细胞待用。1.6.9 DCs表面分子测定取100|1L 1*107 个/ml的DCs悬液(PBS悬浮)，加入指定量的

11、流式抗体：FITC标记的小 鼠CD11c抗体、PE标记的小鼠MHCII抗体、APC标记的小鼠CD86抗体、PE标记的小鼠 PD-L1抗体4C避光孵育1h,PBS洗涤1次，1200rmin-1离心5min，重复一次，用300|1L P BS重悬，上流式细胞仪检测。1.6.10 ELISA测血清细胞因子在酶标板上分别设空白孔和待测样品孔。待测样品孔中加样品稀释液25L,然后再加待测 血清25L,样品最终稀释度为2.5倍。用封板膜封板后置37C孵育30min。揭掉封板膜， 弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒弃去，重复5次。每孔加酶标试剂50|il, 空白孔除外。用封板膜封板后置37C温育30

12、min，洗板5次。每孔先加入显色剂A 50L, 再加入显色剂B 50L，轻轻震荡混匀，37C避光显色15min。每孔加入终止液50L,于 450nm处用酶标仪检测OD值。设定对照孔和样本孔，加入基质液和待测样本，混匀后,37C水浴30min，加入2,4-二硝基 苯肼，混匀后37C水浴20min,加入0.4mol/L的氢氧化钠溶液，室温放置15min,于510nm 处用酶标仪检测OD值(ALT/AST)。设定标准孔、对照孔和样品孔，分别加入标准品、双蒸水和待测样本，加入酶溶液A,37C 孵育5min，于546nm处用酶标仪检测OD值,得到吸光度A1,加入酶溶液B, 37C孵育5min, 于546

13、nm处用酶标仪检测OD值，得到吸光度A2 (CRE、BUN),然后根据说明书附录的计算 公式计算。2实验结果2.1小鼠体重从图中可以看出，与K组相比，给予甲氨蝶吟后小鼠体重下降明显，M组下降幅度最大， 给药组均小于M组，且后期逐渐恢复，其中Jinxing (10mg/kg)组小鼠体重恢复与TP-5组 相当，Jinxing (30mg/kg)组与 Jinxing (20mg/kg)组优于 TP-5 (图 1A)。给予甲氨蝶吟后，各组小鼠出现不同程度的死亡。M组死亡率最高，给药后死亡率降低。其 中Jinxing (20mg/kg)组与Jinxing (10mg/kg)组死亡率最低，且低于TP-5组

14、(图1B)。提示Jinxing可改善甲氨蝶吟对小鼠体重的影响，降低死亡率。图1 A为各组小鼠体重随时间的变化曲线图。B为各组小鼠的死亡率。2.2肾脏病理切片与K组相比，M组小鼠肾间质病变严重，肾小管结构明显受损，有大量胶原生成，给药组 胶原生成明显减少，肾脏损伤减轻。Jinxing30)Jinxing(ZO)Jinxlng( 10)图2各组小鼠肾脏Masson染色图(X200)。2.3小鼠的肝肾功能检测实验检测了反映小鼠肝功能的血清中ALT和AST的水平，以及反映肾功能的血清中CRE和 BUN的水平：M组小鼠血清中ALT水平升高，显著高于K组，给药后均下降，其中Jinxing (30mg/kg

15、) 组和Jinxing (20mg/kg)组具有显著性差异(图3A)；M组小鼠血清AST水平上升，给药后除Jinxing( 10mg/kg)组均下降，其中Jinxing(30mg/kg) 组具有显著性差异(图3B)；M组小鼠血清中CRE水平显著高于K组，给药后均下降，且Jinxing (20mg/kg)组具有显 著性差异(图3C)；M组小鼠血清中BUN水平显著高于K组，给药后除Jinxing (30mg/kg)组均下降，Jinxing (20mg/kg)组具有显著性差异(图3D)。结果提示，Jinxing可降低血清中ALT、AST、CRE和BUN水平，缓解甲氨蝶吟对小鼠肝肾 功能造成的损伤。图

16、3 A为血清中ALT的水平。B为血清中AST的水平。C为血清中CRE的水平。D为血清 中BUN的水平。2.4血清中细胞因子M组TNF-a的含量低于K组，给药后均升高（图4A）,除Jinxing （20mg/kg）组外都有显 著性差异。提示Jinxing可促进血清中TNF-a分泌。M组IL-10的含量低于K组，给药 组都有明显升高趋势（图4B）。提示Jinxing可促进血清中IL-10分泌，Jinxing （20mg/kg） 组升高趋势最明显。C组IL-2的含量显著低于K组，给药均显著上升，提示Jinxing可 促进血清中IL-2的分泌（图4C）。IL-2图4血清中细胞因子水平。A为血清中TNF

17、-a的水平。B为血清中IL-10的水平。C为血 清中IL-2的水平。2.5脾脏、胸腺和淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞M组与K组相比，脾脏、胸腺和淋巴结中的CD4+T细胞CD8+T细胞的比例都下降，给药后 出现不同程度地上升：CD4+T细胞（脾脏）（图5A）：给药后，除Jinxing（20mg/kg）组,CD4+T细胞比例均明显 上升，Jinxing（30mg/kg）组最明显;CD4+T细胞（胸腺）（图5C）：与M组相比，给药组均明显上升，Jinxing（20mg/kg）组最 明显;CD4+T 细胞（淋巴结）（图 5E）:给药后，Jinxing（20mg/kg）组和 Jinxing（10

18、mg/kg）组 轻微上升，Jinxing（30mg/kg）组上升最明显，显著高于TP-5组；CD8+T细胞（脾脏）（图5B）：给药后出现不同程度上升，其中Jinxing（30mg/kg）组上升 最明显，比例高于TP-5组；CD8+T细胞（胸腺）（图5D）：与M组相比，给药组均明显上升，Jinxing （20mg/kg）组最 明显；CD8+T细胞（淋巴结）（图5F）： M组高于K组，给药后均上升，Jinxing （20mg/kg）组Jinxing （10mg/kg）组最明显;结果提示，Jinxing对脾脏、胸腺、淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例都有上调作 用。图5脾脏、胸腺、淋巴结中

19、CD4+T细胞和CD8+T细胞比例。A为脾脏中CD4+T细胞的比例。B为脾脏中CD8+T细胞的比例。C为胸腺中CD4+T细胞的比例。D为胸腺中CD8+T细胞的 比例。E为淋巴结中CD4+T细胞的比例。F为淋巴结中CD8+T细胞的比例。2.6脾脏中NK细胞M组NK细胞比例低于K组，给药后均上升，且上升幅度都高于TP-5组，提示Jinxing对 脾脏中NK细胞的比例有明显上调作用。图7脾脏中NK细胞的比例。2.7脾脏中TCRM组TCR比例低于K组，给药后均上调。Jinxing（10mg/kg）组与TP-5组相当，Jinxing （30mg/kg）组对TCR的上调作用强于TP-5，提示Jinxing

20、能明显上调脾脏中TCR的表达，发挥免疫增强作用。图8脾脏中TCR的比例。2.8脾脏中免疫抑制细胞MDSC： M组MDSC比例高于K组，给药后均下降，提示Jinxing对脾脏中MDSC的比例有下 调作用（图9A）。Treg： M组Treg比例明显高于K组，给药后均下降。Jinxing（20mg/kg）组和Jinxing （10mg/kg）组下降最明显，下降幅度高于TP-5组。提示Jinxing对脾脏Treg的比例有下调作用（图9B）。图9脾脏中MDSC和Treg的比例。A为脾脏中MDSC的比例。B为脾脏中Treg的比例。2.9骨髓来源的DCs 共刺激分子CD86 （图10A）： M组CD86比例

21、低于K组，给药后除Jinxing （10mg/kg）组均 上升，TP-5 组上升幅度最大，Jinxing（30mg/kg）组与 Jinxing（20mg/kg）组相当。MHCII （图10B）： M组MHCII比例低于K组，给药后均上升，Jinxing（20mg/kg）组上升最明显，Jinxing（30mg/kg）组与 TP-5 组相当。脾脏 PD-1 分子/DCs 表面 PD-L1 分子（图 10C、10D）： 脾脏表面PD-1比例，M组轻微低于K组，给药后变化较小。DCs表面PD-L1比例，M组 高于K组，给药后均下降，Jinxing（10mg/kg）组下降最明显，Jinxing（30mg

22、/kg）组与 Jinxing（20mg/kg）组相当，提示Jinxing可下调DCs表面的PD-L1分子。(_*CIl1cC为脾图10 A为DCs表面共刺激分子CD86的比例。B为DCs表面MHCII分子的比例。 脏表面PD1分子的比例。D为DCs表面PD-L1的比例。3实验结论研究结果表明:1、小鼠隔天给予8mg/kg甲氨蝶吟后，体重下降明显，且出现死亡，今幸胶囊能改善甲氨 蝶吟所致小鼠体重下降，降低死亡率。2、甲氨蝶吟导致小鼠免疫功能减弱，M组小鼠脾脏、胸腺和淋巴结中的CD4+T细胞和CD8+T 细胞均减少，给药后，今幸胶囊能显著上调脾脏、胸腺和淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细 胞的比

23、例，上调脾脏中NK细胞和TCR的比例，下调脾脏中Treg的比例，上调DCs表面 CD86和MHCII分子，促进DCs成熟，发挥免疫增强作用；今幸胶囊还能促进血清中TNF-a 和IL-2的分泌，间接调节免疫功能。3、今幸胶囊能降低小鼠血清中ALT、AST、CRE和BUN水平，改善甲氨蝶吟对小鼠肝肾功能 造成的损伤。4参考文献1 甲氨蝶吟血药浓度与患者肝肾功能指标的相关性分析.聂松柳，沈炳香，段自皞，蒋俊 杰，王法财.安徽医药2015(3).2 大剂量阿糖胞苷与甲氨蝶吟化疗对肾损害的探讨.张峰，贾金海.中国医药2006(1).3 甲氨蝶吟周期联合环磷酰胺对OVA小鼠Th17/Treg细胞平衡影响的研究.王黎醒.山 西医科大学.