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1、2023/5/29,1,生物电子显微术,河北农业大学生命学院,2023/5/29,2,生物电子显微术,1 绪论基本概念EM发展史EM分类及特点电镜技术的应用各种显微镜性能与特点的比较2 电子显微镜的基本知识TEM的结构和原理SEM的结构和原理,2023/5/29,3,3 超薄切片技术基本概念普通超薄切片技术4 负染色技术5 金属投影和复型技术金属投影技术复型技术6 EM冷冻制样技术概述冷冻超薄切片技术冷冻断裂(蚀刻)及复型技术冷冻安全规则,2023/5/29,4,7 SEM的样品制备技术 概述SEM电镜的样品制备特殊样品的制备8 电镜的应用(个案分析）花粉表面形态的SEM观察熏蒸固定真菌的SE
2、M观察样品包埋块的制作扫描电镜观察石蜡切片观察法植物原生质体超薄切片的制作真菌菌丝及孢子的包埋,2023/5/29,5,9 X-ray显微分析X-ray微区分析的基本原理X-ray显微分析仪工作的基本原理X-ray显微分析的方法及应用10 其他显微技术扫描隧道显微镜原子力显微镜激光扫描共焦显微镜扫描电-声显微镜,2023/5/29,6,生物电子显微术,课时安排讲授：30学时实验：10学时主要内容：电镜的原理、结构（TEM，SEM）电镜的样品制备技术 1)超薄切片技术 4)金属投影及复型技术 2)负染色技术 5)SEM制样技术 3)冷冻制样技术 6)其他制样技术应用举例,2023/5/29,7,
3、主要参考文献,生物电子显微术 张景强 中山大学出版实用生物电子显微术 林钧安 辽宁科技出版生物电子显微术教程 陈力 北师大出版电子显微镜与电子光学 黄兰友 科学出版生物医学电子显微技术 程时 北医、协和生物学工作者实用生物电子显微术 英 G1976,参考文献1，2，3图书馆均有,2023/5/29,8,第一章 绪论,1.1基本概念1.电子显微镜：简称电镜 利用电子束作为照明源，电磁透镜聚焦成像，并结合特定的机械装置，应用现代电子技术、高真空技术而制成的一种精密电子光学仪器。TEM：Transmission Electron MicroscopeSEM：Scanning Electron Mic
4、roscope,2023/5/29,9,2电子显微术：以电子显微镜为工具，对物质（样品）进行物理、化学、成分、超微结构等方面研究的一种技术。电子显微术定义:电子显微学是凝聚态物理、材料科学、乃至生命科学的交叉学科，是物质科学研究的一个重要组成部分。它是以电子显微学等方法,在原子尺度上对物质的微观结构进行研究分析,从而促进了新物质、新结构、新性能、新现象的发现，极大地推动了新材料、新器件的发展。,2023/5/29,10,3超微结构：指一般光学显微镜不能分辨的细微形态结构（亚显微 结构），直至生物大分子结构（蛋白质、核酸、多糖、脂类）。4电子显微方法：Electron Microscopy 指利
5、用电子与固体样品作用时所发出的信息，对样品 进行微区观察和分析的一种方法。1mm=103 m 1m=103nm 1nm=10 1=10-10m,2023/5/29,11,1.2 电子显微镜的发展概况光学显微镜的发展(LM:light microscope)光镜的诞生人眼分辨率：人肉眼能分辨清楚的两点之间的最短距离用“”表示 13世纪玻璃的发明 制造眼镜、放大镜16世纪 欧洲放大镜=0.01 M=330倍1590年 荷兰眼镜商Hans之子-Janssen装配具有划时代意义的“显微镜”1665年 英国物理学家Robert Hook(虎克)第一台光学显微镜1675年 荷兰Leeuwen.Hook(列
6、文.贺克 M=270倍,共研制247台光镜高倍率的光镜18世纪到19世纪中叶 英、法、意相继研制消色差显微镜 M=15002000 人的视力提高了1000多倍 0.2 m,2023/5/29,12,3.光镜的局限性1878年 德.理论光学家 E.Abbe提出 光镜的最优分辨率 opt=0.4*光波的反射,水波,障碍物:石块,产生的影子,芦苇杆,表1-1 电磁波各光谱区的一些参数及相应的结构分析方法,2023/5/29,14,可见光波长 40008000 opt=0.4*光 紫外线波长=3900130 紫外线显微镜opt=1000 X-ray=1000.5 但无法偏转不能成像 目前,光镜最好分辨
7、率opt=0.160.32 m 结论:利用波长的更短光线做照明光源,可提高分辨率。（OR：波长越短，分辨率越高）电子波波长很短 易于成像，从而导致 电镜的产生和发展,2023/5/29,15,电镜的发展国外情况 电镜产生的三大理论基础 Thomson（1897）证明电子的存在 L.de.Broglie(德.1923)提出微观粒子的波粒二 相 性 H.Busch(德.1926)建立几何电子光学理论电子的存在19世纪50年代 德.波恩Geissler,2023/5/29,16,1858年,Pluker(德.波恩物理学家),发现阴极射线1881年,Hertz(赫兹)只认识到阴极射线具有波动性1897
8、年,Thomson证明阴极射线是带电粒子其荷质比为1011C/Kg波粒二相性 法国.L.de.Broglie提出:一个动量为P,能量为E的自由运动的电子,相当于波长为=h/p,频率为V=E/h,并沿着粒子运动方向传播的平面波.电子束既有粒子性,也有波动性。,2023/5/29,17,几何电子光学理论 电子光学：指研究和利用电子流的偏转、聚焦、成像规律的一门学科。1925年，柏林工学院M.knoll 和 A.Matthias尝试做聚焦的电子束透镜1926年，H.Busch 带有铁轭的短磁透镜聚焦理论D.gabor(M.knoll 的学生）包壳透镜(1948年提出全息技术 全息技术之父并获诺贝尔奖
9、)1928-1929,Ernst.Ruska 极靴磁透镜,现代磁透镜透射电镜的诞生1932年，M.Knoll 和他的学生E.Ruska发明了电镜,放大倍数16倍;改进后75Kv,1.2万倍1939年,西门子制造第一台商品透射电镜1940年,Helmut.Ruska,研究噬菌体,建立第一个开放实验室1986年Ernst.Ruska和Gerd.Binnig、Heinirich.Rothrer获得诺贝尔物理奖,2023/5/29,18,扫描电镜的诞生1935年，M.knoll 设计第一台SEM1956年，二次电子探测器出现1956年，SEM商品化国内情况校外状况TEM1953年，长春光机所第一台 X
10、D-100型 100kv TEM1965年，中科院科仪厂 DX-2型TEM 100kv 5 1970年，上海新跃仪表厂 DXB1_12型TEM 40万1977年，上海新跃 DXB2_12型TEM 80万 2 SEM1975年，中科院科仪厂 第一台SEM DX-3 100 DX-5 60 1980年，中科仪 KYKY-1000B1993年，中科仪 KYKY-2000 KYKY-2800 KYKY-2800B KYKY-3800,2023/5/29,19,STM(scanning tunneling microscope)1987年，中科仪、中科院化学所白春礼等研制 第一台STM SSX-1型国产
11、电镜的缺点：制造工艺粗燥、自动化程度低、清洁度差我校情况1980s DX-2型TEM1996年，KYKY-2800型数字式扫描电镜分辨率6nm，放大倍数10万,2023/5/29,20,1.3 EM分类及特点透射电镜（TEM）原理：利用TE，整幅像同时成立，在荧光板上成象特点：样品超薄 h1000 二维平面像、立体感差分辨率高 opt=2 样品制备复杂观察对象：样品内部超微结构扫描电镜（SEM）原理：利用SE，逐点成像，显像管上成象特点：图象立体感强、可观察一定厚度的样品,2023/5/29,21,样品制备简单，可观察较大的样品分辨率高，3040 倍率连续可变，从4倍15万倍可配附件，进行微区
12、的定量、定性分析观察对象：样品表面微观结构扫描透射电镜（STEM）兼顾SEM/TEM的特点、造价高、可观察较厚样品(0.204m)分辨率不如TEM高,高分辨型0.30.5nm;附件型1.53nm在200KV时，辐射损伤小、污染小能过检测到扫描透射电子，获取更多超微结构信息图像的反差和亮度易调节，切片可以不染色显像方式：荧光屏、显像管 观察对象：表面、内部,2023/5/29,22,超高压电镜（UHVEM:ultra-high voltage electron microscope）HV500kv为超高压电镜，Hvmax=3MV 其特点：穿透能力强、可观察较厚的样品 m 级分辨率高，2（晶格分辨
13、率）单色性好，色差小，成像质量好辐射损伤小体积庞大、结构复杂、价格昂贵、需专用的防护装置观察对象：主要非生物材料的晶格结构、观察细胞骨架 系统（微梁、微丝）,2023/5/29,23,分析电镜（AEM:analysis electron electron microscope)连续X-ray 背底扣除 能量：Z 特征X-ray的能量 特征X-ray 波长：Z 特征X-ray的波长波谱仪（WDS）Wavelength-disperse spectrometer 微区定量分析，4Be 92U 慢2060分，灵敏度高能谱仪（EDS）Energy-disperse spectrometer 微区定性分
14、析，11Na 92U 快23分，灵敏度低,2023/5/29,24,低压扫描电镜（LVSEM:low voltage）HV=1Kv，可观察绝缘物质、生物样品 试样不易发生充放电效应生物分析电镜（BATEM:biologic analysis）TEM+EDS（or：WDS）分辨率高=1.5、分析性能好扫描隧道显微镜（STM:scanning tunneling microscope）M=1000万倍，水平1，垂直0.1 可进行“活体”观察、可在大气、液体环境下直接观察物质表面特征 只能观察导体和半导体的表面结构、非导电的物质需要覆盖一层导电薄膜 STM主要用于研究表面科学、半导体材料、生命科学,
15、2023/5/29,25,优点：可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤。这些特点适用于研究生物样品和在不同试验条件下对样品表面的评价，例如对于多相催化机理、超导机制、电化学反应过程中电极表面变化的监测等。STM在生物领域的应用：STM在生物和有机材料一领域有着广泛的应用前景。尽管目前还存在着如何解释生物样品的STM图象、如何更好地制备生物样品以及选择合适衬底以沉积生物分子等问题，但实际应用中已取得了不少好结果。例如在真空、大气和溶液条件下的DNA研究，球蛋白、胶原蛋白及红血球的研究等。STM在纳米科技中的应用：STM
16、不仅能够对样品表面进行成像，而且还能在纳米尺度上对材料表面进行刻蚀与修饰。由微观到宏观，即直接操纵单个原子和分子，对它们进行排列组合，以形成新的物质，或制造出一定功能的机器这是实现纳米加工的新思想，STM的出现使这一思想变为现实。自从STM问世以来，STM作为一种纳米加工的工具的研究已涉及到表面直接刻写、电子束诱导沉积以及单原子操纵等方面，并取得了一批高水平的研究结果。,2023/5/29,26,硅111面7 7原子重构象 硅片是大家熟悉的制作晶体管和大规模集成电路的半导体材料，为了得到表面清洁的单质材料，要对硅片进行高温加热和退火处理，在加热和退火处理的过程中硅表面的原子进行重新组合，结构发
17、生较大变化，这就是所谓的重构。,2023/5/29,27,液体中观察原子图象 下图所示的是在电解液中得到的硫酸根离子吸附在铜单晶(111)表面的STM图象。图中硫酸根离子吸附状态的一级和二级结构清晰可见。,2023/5/29,28,1990年，IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用35个惰性气体氙原子组成“IBM”三个英文字母。,2023/5/29,29,科学家把碳60分子每十个一组放在铜的表面组成了世界上最小的算盘。与普通算盘不同的是，算珠不是用细杆穿起来，而是沿着铜表面的原子台阶排列的.,2023/5/29,30,这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术
18、在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图。,2023/5/29,31,DNA分子拉成的DNA图象,2023/5/29,32,原子力显微镜（AFM：atomic force microscope)导电样品、非导电样品均可观察分辨率达到原子水平 可以在真空、超高真空、电化学环境、常温低温条件下工作 应用于表面科学、生命科学、材料科学 注：以STM、AFM为基础，衍生出扫描探针显微镜（SPM：Scanning probe microscope）：如激光力显微镜（LFM）、扫描电化学显微镜（SECM）,2023/5/29,33,环境扫描电镜（ESEM）特点：多种真空状态：高、低、超低真空
19、 1Torr=1mmHg柱压力=1/760大气压=133.3Pa 粗真空：76010乇 低真空：1010-3乇 高真空：10-310-8乇 超高真空：10-8乇以下 多种真空条件下可得SE像、BE像，且=4nm样品室可充气体:水气、氮气动态分析：样品温度从-185 1000 制样简单：样品无须镀膜、脱水干燥真正的“环境”条件，可直接观察含水、含油样品缺点：造价太高$30万 Philips,低气压空间,2023/5/29,34,1.4 电镜技术的应用生物科学方面：细胞生物学分子生物学动物学和植物学微生物学医学科学基础医学临床医学农林畜牧科学植物保护良种繁育（遗传育种）土壤改良与成分分析动植物疾病
20、的快速诊断与防治,2023/5/29,35,材料科学机械部件的疲劳、失效分析金属金相学建筑材料分析 其他方面：矿产、地质与考古、海关、造纸、电池生 产、物理学与化学、环境保护,2023/5/29,36,1.5 各种显微镜性能与特点的比较,特征,表一,2023/5/29,37,续表一,特征,2023/5/29,38,树立正确的人类认识观DM机体器官解剖水平（宏观）LM 细胞细胞水平（微观）EM 亚细胞分子结构分子水平（超微观）EM的发展趋势一般形态定量定性X-ray 分析电子衍射俄歇电子能谱能量分散谱仪二维平面三维立体图象重组静态描述动态观察EM+计算机信息处理,2023/5/29,39,思考题
21、,电镜和光镜有何异同？你知道有那几类电镜？试简述各自特点及其用途。电镜中，可否用X-ray取代电子光源？试分析其原因。,2023/5/29,40,2023/5/29,41,2023/5/29,42,2023/5/29,43,2023/5/29,44,2023/5/29,45,2023/5/29,46,2023/5/29,47,2023/5/29,48,2023/5/29,49,2023/5/29,50,2023/5/29,51,2023/5/29,52,2023/5/29,53,2023/5/29,54,2023/5/29,55,2023/5/29,56,2023/5/29,57,2023/5/29,58,2023/5/29,59,2023/5/29,60,2023/5/29,61,2023/5/29,62,2023/5/29,63,2023/5/29,64,2023/5/29,65,2023/5/29,66,2023/5/29,67,2023/5/29,68,2023/5/29,69,2023/5/29,70,2023/5/29,71,2023/5/29,72,2023/5/29,73,2023/5/29,74,2023/5/29,75,2023/5/29,76,2023/5/29,77,2023/5/29,78,2023/5/29,79,2023/5/29,80,
