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1、第十二章毛细管电泳分析法,第一节 概述,1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径玻璃毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳。,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。,1983年H.Jerten把凝胶电泳引入到毛细管电泳中。1984年Terabe等把胶束电泳技术引入到毛细管电泳中，为今后发展新型的毛细管电泳分离模式提供了依据。1989年在胶束电
2、动毛细管色谱模式的体系中，加入手性拆分试剂，实现了对映体的拆分。1988-89年,出现了第一批毛细管电泳的商品仪器。,HPCE的优点：(1)分离效率高，毛细管中心与外界的距离很短，电泳产生的焦耳热很快被散去，有效防止电泳条带的扩散。(2)检测灵敏度高，以样品的绝对量表示。用激光诱导荧光检测器灵敏度可达10-19g(3)样品用量少(4)仪器结构简单，操作方便，环境友好。,第二节 毛细管电泳的基本原理,一、电泳：指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度,qE=fq离子所带的有效电荷；E 电场强度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数(对于球形离子：f=6；离子的表观液态动力学半
3、径；介质的粘度；),溶质在给定的缓冲液中，单位时间在单位电场下移动的距离,二、电渗现象与电渗流,1.电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。,当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow，简称EOF）。,EOF=E/,2.HPCE中电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质,3.HPCE中电渗流的流形,4.HPCE中电渗流的作用,电渗流的速度约等于
4、一般离子电泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef 阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；0=电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。,三、HPCE中影响电渗流的因素,1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同
5、。,3.电解质溶液性质的影响,（1）溶液pH的影响,（2）阴离子的影响（3）离子强度的影响,*,4.温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%3%；,5.添加剂的影响,（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。,（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；,四、淌度,1.绝对淌度(absolute mobilit
6、y)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.表观淌度 ap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：ap=ap E,五、HPCE中的参数与关系式,1.迁移时间（保留时间）HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。,2.分离效率（塔板数）在HPCE中，仅存在纵向扩散，2=2Dt,扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。,由此可得某离子的表观趟度,3.分离度,分离度可按谱图直接由下式计算：,六、影响分离效率的因素区带展宽,1.纵向扩散的影响 在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：2=2Dt 由扩散
7、系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降,实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%2%。,3.焦耳热与温度梯度的影响,散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：（1）减小毛细管内径；（2）控制散热；,4.溶质与管壁间的相互作用,细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度
8、约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。,第二节 毛细管电泳仪,聚四氟乙烯玻璃石英,紫外、激光诱导荧光、电化学（安培法）、化学发光,第三节 分离模式,毛细管区带电泳:(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)毛细管凝胶电泳:(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)毛细管胶束电泳:(Micellar Electrokinetic Chromatography Capillary,MECC)毛细管聚焦电泳:(Capillary Isoelectric Focusing,CIEF)其他,毛细管区
9、带电泳,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出。,最基本分离模式，分离是基于样品中各个组分间质荷比的差异,离子分析,阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；,阴离子分析,加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；,手性化合物分析,加入手性选择剂，形成配合物的稳定常数有
10、差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）,毛细管凝胶电泳,应用了凝胶，粘度大，抗对流性好，并能减小溶质扩散。交联和非交联（线性）的聚丙烯酰胺凝胶。具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。应用于蛋白质和核酸等生物大分子的分离 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。,酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；,缓冲溶液中加入离子型表面活性剂（多用SDS），其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电
11、的胶束。,胶束电动毛细管色谱,负电胶束以较慢的速度向负极移动,中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；,Analytical Chemistry,Vol.81,No.3,February 1,2009,指数富集配体系统进化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术,J.AM.CHEM.SOC.2009,131,69446945,1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,毛细管等电聚焦,蛋白质分析,
