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1、实验二、线粒体的活体染色,一、实验目的：1、观察动物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。2、掌握线粒体的活体染色原理及方法。3、小鼠肝脏细胞线粒体染色及观察。,线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。,二、实验原理：,不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电
2、子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。,三、实验用品,1.器材：显微镜、手术器械、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸、小平皿。2.试剂：Ringer液、1/5000詹纳斯绿B、1%甲苯胺兰。3.材料：人口腔上皮细胞、小白鼠肝细胞。,四、实验方法,（一）人口腔上皮细胞的制备与观察用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上(不可反复涂沫)
3、，滴一滴甲苯胺兰染液，染色5分钟，盖上盖片，吸去多余染液。显微镜下观察可见覆盖口腔表面的上皮细胞为扁平椭圆形，中央有椭圆形核，染成蓝色。,（二）、线粒体的活体染色与观察1、人口腔上皮细胞线粒体的超活染色观察1）取清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上，滴两滴1/5000詹纳斯绿B染液。,2）实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色1015分钟（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。3）在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一
4、些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。,2、小白鼠肝细胞线粒体的活体染色观察 1)用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。2)在干净的平皿中，滴加1/5000詹纳斯绿B溶液，再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(一般需染2030min)。,3)吸去染液，滴加Ringer 溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴在载玻片上，盖上盖玻片进行观察。4)在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜下观察，可见具有l2 个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。,五、作业：1、绘口腔上皮细胞形态结构。,口腔上皮细胞的线粒体分布,洋葱内表皮细胞的线粒体分布,
