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1、实验三 鱼类血液涂片制作与血细胞计数,血液：是一种由血浆和血细胞组成的流体组织，由心脏搏动推动在心血管系统中不断循环流动，具有运输、防御和免疫、维持内环境的相对稳定和参与体液调节等多种功能。,血液具有维持生物体内环境稳态的作用，正常情况下血液中的的各项生理指标处于相对稳定的状态，同时各项指标也能够反映一个生物个体的健康程度，因而血液检测已成为疾病检测最基本的技术。,多种多样的血液检测仪,血液检测能够辅助疾病诊断,血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，也是生物显微制片的基本方法之一，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值。制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片是血液
2、学检查的重要基本技术。,人体血液涂片,血液涂片技术在水产动物疾病检测过程中也有非常重要的作用，比如细菌感染、病毒感染以及血液寄生虫疾病的检测。目前该技术已成为水产技术从业人员的必备技能，也是执业资格考试的重点内容。,涂片经瑞氏-吉姆萨染色液染色后，相应各类细胞呈现不同的着色，从而达到辨别其形态特征的目的。一般细胞的细胞核嗜碱性，能被碱性燃料染成蓝色，而细胞质基质嗜酸性，能被酸性燃料染成红色。,血细胞计数法是将小量待测样品血液的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称细胞计数板），于显微镜下直接计数，根据血液稀释的倍数，进一步推算出血液中血细胞数的一种方法。,鱼类麻醉前后对比示意图
3、,2、血液的采集 将准备好的2mL注射器，抽动活塞用肝素钠溶液将注射器内湿润，为血液的采集做好准备工作。血液的采集按实验2的采血方法进行，采好的血液保存于1.5 mL离心管中待用。,3、推片 取一块边缘光滑的载片做推片。将其一端刮取血滴，迅速使血液均匀分散在推片与载片的接触处。然后使推片与载片呈3040，向另一端平稳地推出，涂片推好后，放置于空气中使之自然干燥。（1）将采出的血液滴在载片上,（2）另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状。,（3）两玻片的角度以30-45为宜，轻轻将双凹片向前匀速推进，即涂成血液薄膜。,（4）血涂片,不良血涂片
4、,4、血涂片染色 先将干燥血片用甲醇固定3-5分钟，将固定的血片置于被pH 6.4-6.8磷酸盐缓冲液稀释10-20倍的吉姆萨染液中，浸染5分钟（标本较少可用滴染法），取出用蒸馏水冲洗，再用伊红复染1分钟，用蒸馏水冲洗，待干后镜检。,冲洗后滴加少量伊红，染色1分钟,直接流水冲洗1分钟（切勿先倒掉染液）,涂片经水洗干燥后镜检,涂片干燥后加吉姆萨染液染色5分钟,二、血细胞计数,血细胞计数板的结构XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格。0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2，分为400个小格，每小格面积是1/400mm2。,1、血液稀释 用
5、10微升移液枪取10微升血液于一新的1.5mL离心管中，再用1000微升移液枪吸990微升生理盐水于离心管中（稀释100倍），轻轻颠倒混匀。2、计数板处理 用无水乙醇或95%乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把盖片覆在计数板上面。3、充液 取干净的计数板平放于实验桌上，将盖玻片置入计数板正中央。用毛细血管吸取已稀释混匀后的血细胞悬浮液，并将管尖轻轻斜置于盖玻片边缘，让血细胞悬液缓慢流出，借毛细管现象而自动流入计数室内。,4、静置 血细胞悬液充入计数室后，静置23分钟，待细胞不再浮动后，于低倍镜下观察计数室内待计数的血细胞分布是否均匀，分布均匀者，方可计数。,5、按图计算计数板
6、的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞。,6、计算 计完数后，需换算出每ml悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为0.01 cm2，高为0.01 cm，这样它的体积为0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1 ml1000 mm3，所以每一大方格内细胞数10000细胞数/ml，故可按下式计算：细胞悬液细胞数/ml4个大格细胞总数/410 000 如计数前已稀释，可再乘稀释倍数。,血细胞计数换算公式：1625：计数个数40010000100稀释倍数（单位：个/ml）2516：计数个数4001000080稀释倍数（单位：个/ml）,4移液枪的使用要按规定使用，使用时不要过力按压移液枪，用完后要将量程回到移液枪的最大量程处。5镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再重新计数。6盖玻片及计数板用过之后，必须立即用水冲洗，但不可用硬物刷洗。计数板晾干或吹风机吹干后，应镜检计数室是否干净，如不干净必须重复洗至干净为止。,
